一种氨苄青霉素残留的检测方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112505320A(43)申请公布日2021.03.16(21)申请号202011289134.1(22)申请日2020.11.17(71)申请人新乡学院地址453000河南省新乡市金穗大道新乡学院(72)发明人张万方何勇马瑞张同雨王蕊康瑞丽朱子任郭晋汝张晨雨(74)专利代理机构北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11465代理人李冉(51)Int.Cl.G01N33/53(2006.01)C12N15/115(2010.01)权利要求书2页说明书8页序列表1页附图2页(54)发明名称一种氨苄青霉素残留的检测方法及应用(57)摘要本发明公开了一种氨苄青霉素残留的检测方法，其利用氨苄青霉素与核酸适配体的特异性结合能使其脱离纳米金粒子表面的特性，并利用杂交链式解链(HCR)将信号放大，通过纳米金溶液吸收光谱的变化建立了一种氨苄青霉素残留的高灵敏检测方法。本发明氨苄青霉素适配体的HCR放大纳米金比色法具有操作简便、解链快速、高灵敏度等优点，可用于氨苄青霉素残留量的快速检测。CN112505320ACN112505320A权利要求书1/2页1.一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，首先设计氨苄青霉素核酸适配体序列及配套发夹DNA探针，并配置成HCR溶液，再利用HCR放大纳米金比色法，通过HCR溶液和纳米金溶液测定氨苄青霉素的残留量；其中，所述氨苄青霉素核酸适配体序列为：AMP‑1：5’‑CCGCCCGCTTAGTAGTTACGCTTACCTCTTGTTAGCGGGCGGTTGTATAGCGG‑3’；SEQIDNO.1；发夹DNA探针的序列为：H1：5’‑CATCTCGGTTTGGCTTTCTTGTTACGGGCATTAGTAGTTACGCTTACC‑3’；SEQIDNO.2；H2：5’‑TAACAAGAAAGCCAAACCGAGATGGGTAAGCGTAACTAGTAATGCCCG‑3’；SEQIDNO.3。2.根据权利要求1所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、氨苄青霉素核酸适配体及配套发夹DNA探针的合成：设计所述氨苄青霉素核酸适配体序列为：AMP‑1，配套发夹DNA探针的序列为：H1和H2，所有的核酸序列均由上海生工生物工程有限公司合成；S2、HCR溶液的配制：将步骤S1中的H1、H2和AMP‑1核酸序列使用ddH2O分别配制成1μM的核酸工作液，分别在90‑95℃解链1‑20min，再在0.5‑2h内缓慢降温至4‑30℃，将处理后的AMP‑1核酸适配体，与处理后的H1和H2发夹型核酸探针混匀，即为HCR溶液，‑80～‑20℃保存备用；S3、纳米金溶液的制备：取氯金酸配制成澄清透明状的0.01‑0.1％氯金酸溶液，在搅拌下不断加热至沸腾，加入0.1‑5％的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸搅拌，烧杯中溶液由浅灰色变蓝、变紫最终为酒红色，即为纳米金溶液，保持搅拌至溶液降至室温，分装，置于4‑30℃中存放，并使用透射电子显微镜对纳米金溶液的聚集状态进行表征；S4、氨苄青霉素残留的检测：分别取所述纳米金溶液和所述HCR溶液，再加入不同浓度的氨苄青霉素，室温下孵育0‑120min，再加入0.1‑4M的NaCl溶液，室温孵育后酶标仪检测吸光度并进行分析，得到线性方程；采用同样方法测试待测食品的吸光度，代入线性方程，得到食品中氨苄青霉素残留量。3.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，处理后的AMP‑1核酸适配体、处理后的H1和H2发夹型核酸探针的体积比为：(1)：(1‑10)：(1‑10)。4.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，所述氯金酸溶液与所述柠檬酸三钠溶液的体积比为：(100‑2000)：(1‑5)。5.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，在步骤S4中，所述纳米金溶液、所述HCR溶液和所述氯化钠溶液的体积比为：(1)：(1‑10)：(1‑10)。6.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，在步骤S4中，所述线性方程为y＝0.1636x+0.025，R2＝0.9953，氨苄青霉素的检测范围是0‑1.2μmol/L。7.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，所述HCR体积浓度为11.5％。8.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，所述NaCl溶液的浓度为1mol/L。2CN112505320A权利要求书2/2页9.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃，时间为30min。10.一种权利要求1‑9任一项所