奶粉中阪崎肠杆菌分离株表型特征分类.docx

奶粉中阪崎肠杆菌分离株表型特征分类阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)属于肠杆菌属的1个新种［1］。本文采用目前应用最广、在微生物鉴定方面得到公认的肠杆菌科细菌生化鉴定试剂(API20E)分析了阪崎肠杆菌的生化反应特性并利用阴沟肠杆菌噬菌体进行裂解试验测定了阪崎肠杆菌的易感性对奶粉中18株阪崎肠杆菌分离株和4株美国典型菌种保藏中心(ATCC)参考菌株进行了表型分类。旨在对奶粉中阪崎肠杆菌分离株的表型特征进行分类以便准确地对其鉴别。现报告如下。1材料与方法1?1材料(1)标准菌株：阪崎肠杆菌ATCC29544ATCC29004ATCC51329ATCC12868。(2)阪崎肠杆菌分离株：分离自国内市场奶粉抽查样品共18株。经AP120E和英国荧光快速微生物鉴定／药敏分析仪2种系统对阪崎肠杆菌的鉴定概率(％)。检验检疫菌种保藏中心(IQCC)10403-1(98?498?48)；10403-2(9894?89)；10403-3(98?499?95)；10403-4(98?492?30)；10403-5(9892?37)；10403-6(9899?35)；10403-7(98?499?3)；10403-8(98?497?96)；10403-9(9897?26)；10403-10(98?495?96)；10403-11(9899?6)；10403-12(98?499?26)；10403-13(9899?26)；10403-14(98100)；10403-16(98?499?51)；10403-17(9898?22)；10403-18(9899?35)；10403-23(9899?6)。(3)试剂与培养基：脑心浸液肉汤(BHI)(美国Difico公司)；胰酪胨大豆胨琼脂(TSA)、营养琼脂(北京陆桥公司)；API20E(法国生物梅里埃公司)；阴沟肠杆菌噬菌体(广州虎克生物技术有限公司)。1?2方法1?2?1菌株培养将每株参考菌株和分离菌株分别接种于灭菌BHI肉汤36℃培养24h再接种于TSA斜面36℃培养24h作为储备菌株试验时从储备菌株用接种环接种于营养琼脂划线分离37℃培养24h形成单菌落。1?2?2阪崎肠杆菌的生化特征及噬菌体裂解实验API20E实验：将试验菌株按照API20E使用说明进行操作36℃培养22～24h后按照说明书滴加相关试剂观察和记录结果。噬菌体裂解实验：接种针轻点生长于营养琼脂上的单个纯菌落通过管壁研磨使其均匀分散在2ml普通肉汤中约100CFU／ml取1接种环(约100μl)菌悬液涂布于经过预处理(90mm20ml放42～44℃恒温箱30min使表面干燥)的营养琼脂表面干燥(同前)取100μl阴沟肠杆菌噬菌体滴加于营养琼脂表面36℃培养22～24h观察裂解结果以融合裂解、不完全裂解和不裂解记录实验结果。1?2?3阪崎肠杆菌的表型特征分类以ATCC参考菌株在API20E上反应的生化特征为生物1型对于阪崎肠杆菌分离株去掉相同的生化反应保留不一致的生化反应项目进行分析每1种与参考菌株不同的生化特性为1种新的表型。2结果2?1API20E测定结果API20E共有21项生化反应主要区别在于伏-普试验(VP)、肌醇和山梨醇方面4株ATCC参考菌株生化反应一致鉴定数值为33053737株分离株与参考菌株一致(38?9％)将参考菌株的表型特征定义为生物1型按照伯杰氏细菌手册分类方法［2］VP、肌醇、山梨醇分别为+、+、-与生物1型相比肌醇阴性为3株比例为16?7％为生物2型；VP阴性9株比例为50％为生物3型；山梨醇阳性2株比例为11?1％为生物4型；尿素阳性1株比例为5％为生物5型；精氨酸阴性1株比例为5％为生物6型。2?2阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验4株ATCC阪崎肠杆菌参考菌株和18株分离菌株经阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验1株分离株被融合裂解编号为IQCC10403-181株为不完全裂解编号为IQCCl0403-13。3讨论1999年Nazarowec-white和Farber对临床和食品中分离到的17株阪崎肠杆菌以及1株ATCC29544进行了表型特征分类［3］以ATCC29544参考菌株表型反应作为生物1型与该生化反应模式比较山梨醇阳性反应株列为生物2型VP阴性为生物3型。本实验采用此方法对22株(包括4株ATCC参考菌株)进行分析但实验结果存在差异。首先ATCC参考菌株反应数值为3305373而不是3304373也即差异在VP实验。本实验4株参考菌株VP反应均为阳性经典考夫曼方法重复实验结果也为阳性伯杰氏手册中阪崎肠杆菌的VP反应阳