基因甲基化与喉鳞状细胞癌的关系.docx

基因甲基化与喉鳞状细胞癌的关系《医学研究生学报》2014年第六期1资料与方法1．1实验方法1．1．1主要试剂及仪器蛋白酶K(北京艾比根生物技术有限公司);Tris．Base(上海拜沃生物科技有限公司);WizardDNAClean-UpSystem(Promega公司);Tap酶(InvitrogenUSA);甲基化转移酶(M．SssI)(NEB公司美国);引物、三氯甲烷、饱和酚、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸钠、无水乙醇(大连宝生生物公司)。恒温水浴箱(SHELLAB公司美国);高速离心机(Eppendorf公司);GeneAmp9700型PCR扩增仪(ABI公司美国);凝胶自动成像仪(TOCAN320型);电泳仪(伯乐公司美国)。1．1．2DNA提取采用标准蛋白酶K消化法进行DNA提取在提取之前组织标本经HE染色证实肿瘤细胞的存在并选择恶性肿瘤细胞≥75%的区域的组织提取DNA。1．1．3亚硫酸氢钠修饰参照《分子克隆实验指南》进行操作［6］:先将约2μgDNA在1．5mLEP管中用双蒸水稀释至50μL加5．5μL新鲜配制的3molNaOH后42℃水浴30min然后加30μL10mmol/L对苯二酚至上述水浴后的混合液中;再加入520μL3．6mol亚硫酸氢钠(配制:1．88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释并以3mol/LNaOH滴定溶液至PH5．0最终体积为5mL)。EP管外裹以铝箔纸避光轻柔颠倒混匀溶液加200μL石蜡油50℃避光水浴16h。1．1．4修饰后的DNA纯化回收预热树脂10min(37℃)将移液器枪头伸入石蜡油层下吸取混合液600μL至一洁净2mLEP管中;然后使用PromegawizardCleanupDNA纯化回收系统对修饰后的DNA进行纯化回收。1．1．5甲基化特异性PCR反应PCR反应体系:去离子水11．65μL;10×buffer2μL;dNTP1．6μL;上、下游引物各1μL;DNA模板3μL;Tap酶0．15μL;加去离子水至20μL。循环参数:94℃预变性5min后35个循环:94℃变性30s54℃复性30s72℃延伸30s最后1个循环延伸5min。将产物琼脂糖凝胶(2．5g/L)电泳GeneFinder染料染色。以甲基化酶处理正常人外周血细胞、去离子水分别作为甲基化阳性对照、甲基化阴性对照及空白对照。每批标本同时扩增甲基化和非甲基化阳性对照。甲基化上游引物:5''''-GTTAGTTTTTTTTTTTATTT-TAGTGGTTCGA-3''''下游引物:5''''-TCCAAAACCTC-CCGAAAACGAAAACG-3'''';非甲基化上游引物:5''''-GGT-TAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTTGA-3''''下游引物:5''''-ATTTCCAAAACCTCCCAAAAACAAAAACA-3''''。1．2统计学分析所有数据均采用SPSS20．0软件进行处理RECK基因启动子区甲基化状况与临床病理参数的关系采用χ2检验必要时采用Fisher确切概率法。对完成至少5年随访的患者行生存分析。生存曲线采用Kaplan-Meier法估计并采用Log-rank检验分析不同组别的差异。危险因素与患者总体生存率的关系采用多因素COX比例风险模型分析以P≤0．05为有统计学意义。2结果2．1临床及病理学特征70例患者中共有37例(52．86%)发生RECK基因甲基化经χ2检验RECK基因甲基化在不同年龄、性别吸烟、饮酒、淋巴结转移与否TNM分期间差异无统计学意义(P＞0．05);肿瘤组织中等及高分化的患者的RECK基因甲基化率远远高于分化程度较低的患者。15名正常人喉黏膜组织均未发现甲基化。见表1。2．2喉鳞状细胞癌及正常组织的甲基化情况37例(52．86%)原发喉鳞状细胞癌标本发生甲基化见图1。29对喉鳞状细胞癌-癌旁组织匹配的标本中喉鳞状细胞癌组织发生RECK基因甲基化16例(55．12%)癌旁组织发生RECK基因甲基化8例(27．59%)经配对四格表资料的精确概率检验2组的甲基化率比较差异有统计学意义(P=0．029)。见表2。2．3RECK基因启动子区甲基化与患者的生存预后的关系本组70例患者中64例完成了5年随访中位无瘤生存期为41个月中位总体生存期为52个月。本研究只针对完成5年随访的64例患者分析RECK基因启动子区甲基化与生存预后的关系。经Log-rank分析RECK基因甲基化可明显缩短患者的无瘤生存期和总体生存期(P=0．017P=0．024)见图2。此外有淋巴结转移、Ⅲ-Ⅳ级临床分期、肿瘤组织中等及高分化与患者较差的预后