玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113341147A(43)申请公布日2021.09.03(21)申请号202110498155.2G01N33/53(2006.01)(22)申请日2021.05.08(71)申请人郑州大学地址450001河南省郑州市高新技术开发区科学大道100号(72)发明人陈玉梅周景明王爱萍刘占祥刘燕凯祁艳华丁培阳朱习芳丁梦浩(74)专利代理机构郑州盈派知识产权代理事务所(普通合伙)41196代理人张晓辉樊羿(51)Int.Cl.G01N33/577(2006.01)G01N33/58(2006.01)G01N33/532(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图5页(54)发明名称玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建与应用(57)摘要本发明公开了一种玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建与应用。本发明通过碳二亚胺法将绿色量子点与抗ZEN单克隆抗体偶联、橙红色量子点与抗OTA单克隆抗体结合，制备出两种免疫荧光探针；通过碳二亚胺法合成的玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN‑OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA‑OVA同时包被在具有高结合力的黑色微量滴定板单个孔中，建立同时定量检测两种真菌毒素的多重荧光免疫分析体系。本发明方法操作简便、高效、灵敏且检测成本低，应用于检测玉米等谷物样品中的ZEN和OTA的毒素残留具有较好的准确性。CN113341147ACN113341147A权利要求书1/2页1.一种玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）免疫原的合成分别采用肟化法和碳二亚胺法合成免疫原玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN‑BSA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA‑BSA作为免疫原；（2）单克隆抗体的制备分别以所述ZEN‑BSA和OTA‑BSA作为免疫原，采取皮下多点注射的方式免疫6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，免疫剂量为30μg/只；免疫间隔14天，四免后剪尾采血，间接ELISA测定免疫小鼠血清效价，竞争ELISA测定免疫鼠多抗血清的敏感性；从中选取敏感性最好的免疫小鼠脾脏进行细胞融合，经3～5轮亚克隆制备阳性杂交瘤细胞株，体内诱生腹水制备抗ZEN单克隆抗体和抗OTA单克隆抗体；（3）免疫荧光探针的合成以EDC法分别合成以绿色ZnCdSe/ZnS量子点标记的抗ZEN单克隆抗体以及以橙红色ZnCdSe/ZnS量子点标记的抗OTA单克隆抗体；（4）完全抗原的合成通过碳二亚胺法合成的玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN‑OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA‑OVA作为包被原；（5）将玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN‑OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA‑OVA同时包被在具有高结合力的黑色微量滴定板单个孔中，建立同时定量检测两种真菌毒素的多重荧光免疫分析体系。2.根据权利要求1所述的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，筛选制得抗ZEN单克隆抗体mAbA1和抗OTA单克隆抗体mAbA2。3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，以绿色量子点与mAbA1偶联制备出anti‑ZEN‑mAb‑QDs，以橙红色量子点与mAbA2结合制备出anti‑OTA‑mAb‑QDs。4.根据权利要求1所述的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，首免时免疫原与弗氏完全佐剂混合乳化；加强免疫与弗氏不完全佐剂混合乳化。5.一种用于同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测试剂盒，含有包被微量滴定板：以权利要求1中所述玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN‑OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA‑OVA作为包被原包被的黑色96孔酶标反应板；免疫荧光探针：以绿色量子点标记的权利要求1所述抗ZEN单克隆抗体，和以橙红色量子点标记的权利要求1所述抗OTA单克隆抗体。6.根据权利要求5所述的用于同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述ZEN‑OVA、OTA‑OVA的最佳包被浓度为2μg/mL。7.一种同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：（1）标准液配置取ZEN标准母液依次稀释为10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、2CN113341147A权利要求书2/2页0.3125ng/mL、0.15625ng/mL；取OTA标准母液依次稀释为50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5625ng/mL、0.78125ng/mL；（2）样