丹参枯萎病及其病原菌的研究.docx

丹参枯萎病及其病原菌的研究[摘要]丹参是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物栽培丹参枯萎病发生严重严重影响栽培丹参产量和质量。针对上述问题采用形态学和病原学实验手段对从发生枯萎病丹参植株茎和根中分离得到的病原菌进行鉴定同时根据ITS序列采用PCR的方法进行进一步确定。结果表明丹参枯萎病多发生7―8月高温、多雨季节栽培一年丹参枯萎病的发生率为10%左右而栽培三年或者三茬丹参枯萎病的发生率达到了60%～70%。枯萎病会引起丹参根腐因此生产上易误认为根腐病。形态学鉴定结果表明该病原菌为尖孢镰刀菌ITS序列也表明其与黄瓜枯萎病菌的ITS序列同源性为99%。因此作者认为引起丹参枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌。[关键词]丹参；枯萎病；病原菌鉴定；尖孢镰刀菌丹参SalviamiltiorrhizaBge俗称活血根唇形科多年生草木以干燥的肉质根入药[1]是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物。过去主要以野生为主20世纪60―70年代的四川、山东、河南、陕西等地广泛发展种植并成为丹参主产区[2]。但是药用植物讲究“地道药材”具有地域性对环境条件有着严格的要求因此适宜人工栽培的土地面积就十分有限。为了满足市场要求很难避免重茬连作情况出现。丹参随着连作和种植年限的延长根部病害严重发生主要有枯萎病和根腐病[3-4]2种病害通常混合发生。病菌侵袭丹参植株后会导致植株根系腐烂叶片枯黄严重时植株大面积枯死丹参严重减产有效成分降低[5]。但是目前关于丹参枯萎病病原菌的相关研究极少只有王刚云等报道陕西商洛栽培的丹参枯萎病病原菌主要有尖孢镰孢和链格孢属[4]。另外上述的研究结果没有对病原菌进行系统的研究特别是没有致病性试验结果。本研究采用形态学和分子鉴定等方法并结合致病性测定对丹参枯萎病病原菌进行了研究旨在为研究丹参枯萎病的诊断和制定防治措施提供参考。1材料和方法1.1材料2010年7月、2010年12月、2011年5月先后3次在山东莱芜白花丹参SalviamiltiorrhizaBge.f.alba种植基地发病严重的地块采集具有典型丹参枯萎病症状的病株。1.2病原菌的分离和培养取具有典型丹参枯萎病症状的病株按照常规组织分离方法进行病原菌的分离纯化：选取根部和茎基部病健交界处以及茎部组织用75%的乙醇消毒3～5s后放入0.1%升汞溶液中消毒5min再用无菌水冲洗3次后晾干用灭菌刀片将带病组织块分割成约3～4mm的小组织块接于PDA平板上每皿4～5小块28℃条件下黑暗培养5d后挑取组织块周围的菌落转皿进行纯化对分离物进行归类、编号和转管保存[6]。1.3致病性接种按照柯赫氏法则采用蘸根接种法[7]对分离物进行致病性测定。将3～5片真叶的丹参健康幼苗根系浸泡在含有1×106个孢子/mL菌悬液中15min后置于无菌土中进行栽培并以无菌水作为空白对照。在25℃温室中进行培养并观察记录发病情况并对发病后的丹参进行病菌再分离。1.4病原菌的形态学观察将病原菌移接于PDA平板上28℃暗培养5d后用5mm的打孔器在菌落边缘打孔取样将菌落转移至直径为9cm的培养皿中央（标准PDA平板）28℃下暗培养5d后用十字交叉法测量菌落生长直径记录菌落形态特征在光学显微镜下观察病原菌的分生孢子和分生孢子梗等菌体形态并测量其大小。根据病原菌的产孢结构和其他特征及在PDA培养基和绿豆培养基[23]上的形态特征并依据Booth′s镰刀菌分类标准进行[8]形态学鉴定。1.4病原菌的分子鉴定从培养基上直接刮取菌丝体放入1.5mL灭菌离心管中用研磨棒研磨菌丝采用CTAB法提取菌株DNA[9-10]。采用引物ITS1ITS2（真菌通用引物）Fu1和Fu2（镰刀菌属特异引物）Fga1和Fga2（编码尖孢镰刀菌G蛋白α亚基的基因引物）进行PCR扩增。25μLPCR反应体系包括10×PCRbuffer2.5μLMgCl2（25mmol・L-1）2.5μLdNTP（10mmol・L-1）0.5μL模板DNA溶液1μL5U・μL-1Taq酶0.2μL10pmol・μL-1ITS1和ITS2引物（由上海生工合成）各0.5μL超纯水17.3μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s52℃退火40s72℃延伸1min35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测BioRad凝胶成像系统观察、照相。扩增产物经l%琼脂糖凝胶电泳分离切胶回收纯化后送北京华大基因工程技术服务有限公司进行测序。测得序列在GenBank数据库中进行同源性比较。2