一株自养硝化细菌培养条件的优化.docx

一株自养硝化细菌培养条件的优化摘要：针对前期筛选的自养硝化杆菌（Nitrobacter）菌株y3-2以实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR）测定的菌液终浓度为指标设计单因素试验和正交试验对其培养基和培养条件进行优化。结果表明优化的硝化杆菌y3-2的培养基中CaCO3、Na2CO3、NaNO2浓度分别为0.5、1.0、0.5g/L。最佳培养条件为培养温度28℃、pH8.0、摇床转速200r/min。优化后硝化杆菌y3-2的发酵周期由优化前的7d缩短至4d菌液终浓度达到4.31×109CFU/mL。关键词：硝化杆菌（Nitrobacter）；培养基；培养条件；优化中图分类号：Q939.96文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）15-3628-04氮素是水体污染源的主要成分之一水体的脱氮技术已经成为人们关注与研究的热点[1]。与传统的物理化学脱氮工艺相比生物脱氮具有成本低、效率高、无二次污染等优势。现今采用最多的生物脱氮工艺为硝化―反硝化工艺其中的硝化工艺由硝化细菌（Nitrifyingbacteria）完成[2]。硝化细菌分为自养型硝化细菌和异养型硝化细菌2类异养型硝化细菌仅占很少一部分自养型硝化细菌是生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群其硝化速率直接影响污水处理系统的硝化效果和生物脱氮效率[3]。硝化过程通常由氨氧化细菌（Ammonia-oxidizingBacteriaAOB）先将氨氮转化为亚硝酸盐然后由亚硝酸氧化细菌（Nitrite-oxidizingBacteriaNOB）将亚硝酸盐转化为硝酸盐[4]。与自养型AOB一样自养型NOB具有生长速度慢、自然条件下数量低等特点这一方面使NOB的研究较为困难另一方面也制约了其工业化生产和应用。因此研究加快NOB生长速度的培养方法显得尤为重要[56]。本研究以一株亚硝酸氧化细菌y3-2[7]为出发菌株对其培养基和培养条件进行了优化并采用实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-timequantitativePCRdetectingsystemqPCR）计数的方法对其菌液浓度进行计数以期获得能快速培养硝化杆菌y3-2的方法。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种试验用菌种硝化杆菌y3-2由农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室分离纯化保藏经16SrDNA鉴定为硝化杆菌属（Nitrobacter）细菌。1.1.2优化前培养基及培养条件优化前初始培养基：MgSO4・7H2O0.12g/L、NaH2PO4・2H2O1.16g/L、K2HPO4・3H2O0.33g/L、MnSO4・H2O0.0076g/L、（NH4）6Mo7O24・4H2O50μg/L、无水NaCO30.5g/L、NaNO21.0g/L、pH7.5121℃、30min灭菌。优化前的培养条件为250mL三角瓶加入50mL培养基200r/min、30℃恒温培养。1.1.3试剂亚硝酸盐和硝酸盐定性检测试剂[8]：Griess试剂、盐酸溶液、氨基磺酸铵溶液、二苯胺―硫酸试剂细菌基因组DNA提取试剂盒和RealMasterMix（SYBRGreen）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司硝化杆菌qPCR标准样品为农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室自制。1.2方法1.2.1培养基的优化1）单因素试验。设计单因素试验分别考察培养基中CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对试验菌株生长的影响。①CaCO3浓度。Na2CO3浓度1.5g/LNaNO2浓度0.5g/LCaCO3浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0g/L。②Na2CO3浓度。CaCO3浓度0.5g/LNaNO2浓度0.5g/LNa2CO3浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0g/L。③NaNO2浓度。CaCO3浓度0.5g/LNa2CO3浓度1.5g/LNaNO2浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g/L。每个单因素试验设置3个平行每天定性检测NO2-、NO3-含量观察NO3-生成情况记录NO2-完全硝化所需时间并对细菌进行计数。2）正交试验。设置三因素三水平正交试验考察CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对细菌生长的影响每个试验设置2次重复。1.2.2培养条件的优化采用优化后的培养基培养菌株设置单因素试验考察培养温度、pH和转速对菌株生长的影响。①温度。将种龄为48h的新鲜菌液以5%的接种量接