在高温下表达和分泌异源蛋白的酵母菌株.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108291213A(43)申请公布日2018.07.17(21)申请号201680057761.8特丽莎·巴雷特阿龙·阿吉罗斯(22)申请日2016.08.29(74)专利代理机构北京康信知识产权代理有限责任公司1(30)优先权数据124062/214,4122015.09.04US代理人张英沈敬亭62/299,8972016.02.25US(51)Int.Cl.(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12N9/30(2006.01)2018.03.30C12N15/81(2006.01)C07K14/39(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据PCT/IB2016/0551622016.08.29(87)PCT国际申请的公布数据WO2017/037614EN2017.03.09(71)申请人拉勒曼德匈牙利流动性管理有限责任公司地址匈牙利布达佩斯权利要求书3页说明书34页(72)发明人查尔斯·F·赖斯瑞安·斯金纳序列表31页附图12页(54)发明名称在高温下表达和分泌异源蛋白的酵母菌株(57)摘要本公开涉及能够维持在高温下的稳健性的重组酵母菌株以及由所述重组酵母菌株表达的重组蛋白。本公开还提供使用所述重组酵母菌株制备发酵产物的方法。本公开进一步提供一种用于制备能够维持在高温下的稳健性的重组酵母菌株的方法。CN108291213ACN108291213A权利要求书1/3页1.一种包含异源核酸分子的重组酵母宿主细胞，所述异源核酸分子具有可操作地连接至编码第一异源蛋白的第一核酸分子的第一启动子，其中：-当与相应的第一天然异源蛋白相比时，所述第一异源蛋白包含至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代维持或提高了所述重组酵母宿主细胞在高温下的稳健性；和/或-当与所述重组酵母宿主细胞置于至少部分需氧条件下获得的所述第一异源蛋白的表达水平相比时，当所述重组酵母宿主细胞处于至少部分厌氧条件下时，所述第一启动子能够增加所述第一异源蛋白的表达。2.如权利要求1所述的重组酵母宿主细胞，其中所述异源核酸分子还包含第二启动子，当所述重组酵母宿主细胞处于至少部分厌氧条件下时所述第二启动子能够增加所述第一异源蛋白的表达，并且其中所述第二启动子可操作地连接至所述第一核酸分子。3.如权利要求1或2所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一启动子和所述第二启动子选自由以下组成的组：tdh1p、pau5p、hor7p、adh1p、tdh2p、tdh3p、gpd1p、cdc19p、eno2p、pdc1p、hxt3p及tpi1p。4.如权利要求3所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一启动子和所述第二启动子是pau5p和tdh1p。5.如权利要求1至4中任一项所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一异源蛋白当与相应的第一天然异源蛋白相比时包含引入推定的糖基化位点的第一氨基酸取代。6.如权利要求5所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一氨基酸取代位于所述第一异源蛋白的N末端区域中。7.如权利要求5或6所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一氨基酸取代在所述第一异源蛋白中引入天冬酰胺残基作为所述推定的糖基化位点。8.如权利要求1至7中任一项所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一异源蛋白是裂解酶。9.如权利要求8所述的重组酵母宿主细胞，其中所述裂解酶是糖解酶。10.如权利要求9所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一异源蛋白是葡萄糖淀粉酶。11.如权利要求10所述的重组酵母宿主细胞，其中所述相应的第一天然蛋白具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。12.如权利要求11所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一异源蛋白具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的氨基酸序列。13.如权利要求9所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一异源蛋白是α-淀粉酶。14.如权利要求13所述的重组酵母宿主细胞，其中所述相应的第一天然蛋白具有SEQIDNO:6的氨基酸序列。15.如权利要求14所述的重组酵母宿主细胞，其中所述第一异源蛋白具有SEQIDNO:7的氨基酸序列。16.如权利要求1至15中任一项所述的重组酵母宿主细胞，其是来自于酵母属(genusSaccharomyces)。17.如权利要求16所述的重组酵母宿主细胞，其是来自于酿酒酵母种(speciesSaccharomycescerevisiae)。18.如权利要求1至15中任一项所述的重组酵母宿主细胞，其来自于酵母属(genus2CN108291213A权利要求书2/3页Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Arxula属(Arxula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、