双荧光素酶报告系统.doc

双荧光素酶报告系统双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CATβ-GalGUS)不够便利因为各自的测试化学处理要求检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统结合pRL载体系统表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶在单管中进行双荧光素酶报告基因测试快速灵敏简便。系统还提供PLB裂解液用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测通常一个报告基因作为内对照使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关偶联到组成型启动子的第二个报告基因提供转录活力的内对照使测试不被实验条件变化所干扰。通过这种方法可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性比如培养细胞的数目和活力的差别细胞转染和裂解的效率。使用萤火虫荧光素酶结合氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶(β-Gal)或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行但CATβ-Gal和GUS测试法则在定量前需要长时间的保温。另外这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围必须注意不要超过这些范围内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达不利于准确定量报告基因表达胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温下预处理细胞裂解液(12)会降低内源性β-Gal和CAT测试的干扰但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此在此类双报告基因检测中必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因如CATβ-Gal和GUS是不可能的由于它们测试化学处理要求所固有的局限。相反结合萤火虫(Photinuspyralis)和海洋腔肠(Renillareniformis)双荧光素酶Promega的双荧光素酶报告基因测试(DLR)系统可满足这些要求在单管中完成这些测试。双荧光素酶报告基因测试化学荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点但它们在进化上的起源不同因此具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别用来发展了DLR测试化学选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火虫荧光素酶是一个61kDa单亚基蛋白质酶活力不需翻译后修饰(34)在翻译后即可作为遗传报告基因。在ATPMg2+和O2存在下通过甲虫荧光素的氧化反应发光(图1)。在常规反应条件下荧光素的氧化发生时以荧光素-AMP作为中间体转换非常缓慢。结果在底物和酶混合后测试化学产生"闪烁"的光并迅速衰减。专利化的测试试剂定量萤火虫荧光素酶活力掺入了辅酶A(CoA)增强快速酶转换来提高反应动力学(5)导致持续的"闪烁"发光信号(图2)。图1由萤火虫和Renilla荧光素酶催化的生物发光海洋腔肠荧光素酶一个36kDa单亚基蛋白质纯化自天然来源的Renillareniformis(6)含有3%的碳水化合物但是和萤火虫荧光素酶一样酶活力不需翻译后修饰在翻译后即可作为遗传报告基因。海洋腔肠荧光素酶所催化的发光反应利用O2和海样腔肠荧光素(coelenterazine)(图1)。当用DLR测试化学作实验时海洋腔肠荧光素酶反应的动力学产生闪烁型发光信号在检测过程中缓慢地衰减(图2)。在DLR测试系统中用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力。在完成萤火虫荧光素酶活力("实验"报告基因)的测定后萤火虫发光被快速湮灭并同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光反应("对照"报告基因)。因此DLR测试系统整合了两个测试化学对共表达的两个报告基因作快速地定量酶来自转染细胞裂解液或无细胞转录/翻译反应。萤火虫荧光素酶测试的线性范围延伸达酶浓度的8个数量级可测定≤1fg