【精编医学资料】TUNEL染色检测细胞凋亡.docx

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30﹪的染色体DNA在Ca²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下在核小体单位之间被随机切断形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端从而可进行凋亡细胞的检测这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂因而没有3’-OH形成很少能够被染色。低分子量的DNA分离后也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nicktranslation）使低分子量的DNA标记或染色然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定并可检测出极少量的凋亡细胞灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。一、过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端与dATP形成异多聚体并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下过氧化物酶可产生很强的颜色反应特异准确的定位出正在凋亡的细胞因而可在普通光学显微镜下进行观察。毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。(一)试剂配制1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐50mMNaCl200mM。2、蛋白酶K（200μg/mlpH7.4）：蛋白酶K0.02g；PBS100ml。3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O22.0ml；PBS缓冲液98.0ml。4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱3.63g用0.1NHCl调节pH至7.2加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g。5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液76μl混匀置于冰上备用。6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17.4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O1000ml7、0.05％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB5mg；PBS10mlpH7.4临用前过滤后加过氧化氢至0.02%。8、0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。9、100％丁醇100％、95％、90％、80％和70％乙醇二甲苯10％中性甲醛溶液乙酸松香水等。10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）（二）实验步骤1、标本预处理：（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中用二甲苯洗两次每次5min。用无水乙醇洗两次每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次每次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液（20ug／ml）于室温水解15min去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次每次2min然后按下述步骤2进行操作。（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中于室温固定10min后去除多余液体。用PBS洗两次每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中于-20℃处理5min去除多余液体。用PBS洗两次每次5min然后按下述步骤2进行操作。（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5×107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min。在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次每次5min然后按下述步骤2进行操作。2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS于室温反应5min。用PBS洗两次每次5min。3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液置室温1～5min。4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体立即在切片上滴加54μlTdT酶反应液置湿盒中于37C反应1hr（注意：阴性染色对照加不含TdT酶的反应液）。5、将切片置于染色缸中加入已