【精编医学资料】BCA蛋白浓度测定-酶标仪法.docx

4BCA法测定蛋白浓度-酶标仪一、药品BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012500次酶标仪碧云天）含以下成分：BCA试剂A（P0012-1100ml碧云天）室温保存BCA试剂B（P0012-23ml碧云天）室温保存蛋白标准（5mg/mlBSA）（P0012-31ml碧云天）-20度保存二、仪器和试剂酶标仪（测定波长为540-595nm之间562nm最佳）水浴锅96孔单条可拆酶标板（平底）15ml离心管1个（准备BCA工作液用）1.5ml离心管1个（准备蛋白标准品工作液用）单道移液器和枪头8道移液器（排枪）和枪头PBS三、操作步骤水浴锅调至37℃。蛋白标准品工作液（1mg/ml）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-20℃冰箱中取出完全溶解并混匀。取60μl蛋白标准品（5mg/ml）加入240μlPBS即稀释5倍即配成蛋白标准品工作液（1mg/ml）。计算BCA工作液总量=0.2ml×（样本数+8）×2×1.1（标准品和样本均需测复孔）。BCA工作量按50体积的BCA试剂A加上1体积的BCA试剂B配制（即50:1）需充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。样本数(n)1~56~78~1011~1213~1415~1617~1920~2122~2324~26A（ml）6789101112131415B（ml）0.120.140.160.180.20.220.240.260.280.3总量(ml)6.127.148.169.1810.211.2212.2413.2614.2815.3按下表配制8个蛋白标准液（S0~S7）充分摇匀。单条酶标板蛋白标准品工作液（1mg/ml）(l)PBS(l)蛋白标准品终浓度(mg/ml)AS001000BS15950.05CS210900.1DS320800.2ES430700.3FS540600.4GS650500.5HS710001.0将96孔酶标板的A1孔放在左上角按下表加入蛋白样本和标准品。先在第3~4条酶标板的蛋白样本孔（N1~N8）中加入待测蛋白样本各2μl再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18μl使总量达到20μl。（此时蛋白样本的稀释比为10适用于预计蛋白浓度为2~8mg/ml时。如预计蛋白浓度太高或太低可适当调整稀释比例）再在第1~2条酶标板的蛋白标准品孔（S0~S7）中加入上面配制的8个蛋白标准液各20μl。123456789101112AS0S0N1N1BS1S1N2N2CS2S2N3N3DS3S3N4N4ES4S4N5N5FS5S5N6N6GS6S6N7N7HS7S7N8N8用排枪在各孔中加入200μlBCA工作液轻轻摇匀37℃放置30分钟或室温放置2小时。（注意：①每次测定时必须都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深且显色反应的速度和温度有关所以除非精确控制显色反应的时间和温度否则每次都做标准曲线。②如果浓度较低可适当地延长孵育时间或在较高温度孵育。）用酶标仪测定562nm下标准品和样本的吸光度。用标准蛋白质量为横座标用吸光度值A562为纵座标做标准曲线用线形回归计算公式Y=AX+B。根据样本的吸光度计算待测样本的蛋白浓度（注意待测样本的稀释倍数）。按WB实验的要求稀释为2.5mg/ml分装为每支100μl。内容总结（1）用排枪在各孔中加入200μlBCA工作液轻轻摇匀37℃放置30分钟或室温放置2小时（2）因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深且显色反应的速度和温度有关所以除非精确控制显色反应的时间和温度否则每次都做标准曲线（3）按WB实验的要求稀释为2.5mg/ml分装为每支100μl