烟粉虱病原真菌的分离鉴定及生物活性初步研究.doc

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烟粉虱病原真菌的分离鉴定及生物活性初步研究

【摘要】：^p：对田间分离的死亡烟粉虱虫体进行保湿培养，分离得到1株具有杀虫活性的菌株，通过对该菌株的形态、培养特征的观察及对其ITS核酸序列进行扩增与分析^p，鉴定该菌株为玫烟色棒束孢（Isariafumosorosea）。采用浸渍法测定该菌株对烟粉虱2龄若虫的生物活性，结果表明，在孢子浓度为1.0×107CFU/mL时，孢子加菌丝悬浮液处理的虫体死亡率最高，其72h和120h的平均死亡率分别为39%和62%，其次为单用孢子悬液处理，死亡率分别为35%和52%，但两者无显着差异，单用菌丝处理的死亡率最低，分别为20%和38%，与前2种处理方式结果有显着性差异，说明菌株QH1可能主要是通过孢子侵染烟粉虱虫体而表现出杀虫活性。
【关键词】：^p：烟粉虱；病原真菌；分离鉴定；生物活性
中图分类号：S433.39文献标志码：A
文章编号：1002-1302（20________）11-0148-03
烟粉虱（BemisiatabaciGennadius）广泛分布于除南极洲以外的90多个国家，是一种杂食性害虫，其寄主植物超过600种，包括棉花、多种蔬菜以及多种观赏植物和花卉[1-2]。烟粉虱危害方式多样，不仅可以直接吸取植物汁液、分泌蜜露，还可以传播多种植物病毒，给农业生产带来了严重的危害[3]。因此，如何对烟粉虱进行有效的治理和控制引起了国内外学者的广泛重视，并积极研究有效防控烟粉虱的策略和方法。实践证明一些农业和物理防治措施对预防和控制田间烟粉虱是很有效的，按照可持续控制的理念，生物防治在烟粉虱的综合防治中扮演着非常重要的角色。目前，国内外学者在烟粉虱天敌的基础研究和应用方面已经做了大量工作，并在农业生产实践中发挥着重要作用，其中病原真菌的寻找和应用是生物防治的主要研究内容之一。已报道的烟粉虱病原真菌种类繁多，且多为丝孢菌纲，主要包括轮枝菌（Verticillium）、拟青霉菌（Paecilomyces）和座壳孢属（Aschersonia）的一些种类[4]。这些天敌中的很多都能取食或寄生大量烟粉虱，在控制烟粉虱时起着重要作用。
玫烟色棒束孢（Isariafumosorosea）是一类较为常见的昆虫病原真菌，曾称为玫烟色拟青霉（Paecilomycesfumosoroseus），属子囊菌亚门核菌纲，肉座菌目，虫草菌科棒束孢属，能寄生蜱螨目、等翅目、缨翅目、半翅目、鳞翅目、双翅目和鞘翅目等目的多种害虫[5]。玫烟色棒束孢也是常见的土壤微生物，具有较广泛的地理分布和较强的生态适应能力，因此，开发和利用该类昆虫病原真菌已成为生物防治中控制害虫危害的一个重要手段和发展趋势。目前，国外已筛选出对粉虱、蚜虫等刺吸式口器害虫高致病力的菌株，并将其应用于大田和温室的害虫防治[6]。本研究从金陵科技学院园艺站采集感染真菌死亡的烟粉虱虫体，经分离纯化得到了菌株QH1，在观察了该菌株的形态特征、菌落生长特征以及菌株显微特征的前提下，采用分子生物学手段对该菌株进行了鉴定，并初步测定了该菌株对烟粉虱的杀虫活性。
1材料与方法
1.1烟粉虱病原真菌的分离纯化
将田间收集的死亡烟粉虱虫体放入70%乙醇中浸3～5s后，用0.5%次氯酸钠消毒3～5min，灭菌水中连续漂洗3次。用无菌操作法将病虫体移至培养基平面上，每培养皿内放3个虫体，呈三角形，每个处理3个重复，翻转培养皿，放入25℃恒温箱内培养3～4d后，在培养皿中选择菌落，挑取少许菌丝及孢子，接种培养，反复接种纯化菌株。
1.2烟粉虱病原真菌形态特征的观察
1.2.1琼脂水法用蒸馏水和2%的琼脂粉混合溶解后灭菌备用，试验前取少量融化的培养基滴加到载玻片中央，培养基应滴得尽可能圆且薄，待冷却后，吸取已配制好的稀释到一定浓度的孢子液到培养基上，放入已灭菌的装有滤纸片的培养皿中保湿培养，并置于28℃的恒温箱中培养，10h后用显微镜观察，隔天观察1次，并记录孢子的萌发、菌丝体生长和产孢结构形成的过程。
1.2.2菌落形态观察将纯化的菌株接种于PDA上，于25℃恒温箱内培养，记录在培养基上培养10d后菌落直径大小、颜色变化，并在奥林巴斯显微镜下镜检分生孢子的形状，测量分生孢子大小以及产孢细胞大小、着生方式和形态特征等情况。
1.3菌株QH1的分子鉴定
挑选菌株进行培养和DNA提取，用真菌DNA提取试剂盒提取基因组的DNA。引物为真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），扩增ITS1-5.8S-ITS2rDNA全序列及部分18SrDNA和28SrDNA序列。PCR反应体系为25μL，包括：10×PCR缓冲液（100mmol/LTris-HCl，500mm