【精编医学资料】实体瘤组织单细胞悬液制备.doc

实体瘤组织单细胞悬液制备及培养方案单细胞悬液制备仪器、材料及试剂仪器：(1)CO2培养箱（调至37℃）离心机水浴锅（37℃）血球计数板；(2)无菌器械：细胞培养瓶50ml离心管平皿吸管移液管纱布200目/300目尼龙滤网手术器械。材料：肿瘤造模成功的大鼠试剂：RPMI1640培养基（含10%小牛血清）0.25%胰酶Hank’s液/PBS缓冲液碘酒附：Hank’s液配方：KH2PO4：0.06g；NaCl：8.0g；NaHCO3：0.35g；KCl：0.4g；Glucose：1.0g；Na2HPO4·H2O：0.06g；加H2O定容至1000ml注：Hank’s液可以高压灭菌4℃下保存。操作步骤机械-胰酶消化法取材：制备实体瘤单细胞悬液肿瘤取材部位非常重要体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区取材时尽量避免用退变组织挑选活力较好的部位。将大鼠麻醉置75%酒精泡3-5min（时间不能过长以免酒精从口和肛门浸入体内）固定后再用碘酒消毒腹部带入超净台内解剖取肿瘤组织置于平皿中。用Hank’s液/PBS缓冲液洗涤三次并剔除周围脂肪、结缔组织、血液等。用无菌眼科手术剪将肿瘤剪成小块（1-2mm）再用Hank’s液/PBS缓冲液洗涤三次转移至50ml离心管中。视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液37℃中消化20-40min每隔5min轻轻振荡一次或用吸管吹打一次使细胞分离。加入2-5ml含血清培养基以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。静置2-3min使未分散的组织块下沉将悬液转移到新的离心管中。用200/300目尼龙网过滤悬液2次。将过滤后悬液1000rpm离心5-10min弃上清液。加入Hank’s液/PBS缓冲液5ml轻轻冲散细胞再离心一次弃上清液。视细胞量加入l-2ml培养液血球计数板计数。将细胞调整到5×105/ml左右转移至25ml细胞培养瓶中37℃下培养。或者直接用作流式分析及其他分析。实体瘤组织中抗癌药物含量检测按上述取材步骤取出合适的肿瘤组织分成A、B两份分别置于含有1-2mlPBS缓冲液的无菌离心管中（离心管及PBS液已称重）准确称量肿瘤组织的重量。A组可直接用于检测组织中抗癌药物的含量B组用于检测细胞内抗癌药物含量。B组组织按照上述步骤制成单细胞悬液制备过程中保留每一次的PBS洗液（1-2ml）标记清楚用于检查含药量。将单细胞悬液计数统计细胞总量检查细胞内抗癌药物含量。肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格一般常用的RPMIl640、DMEM、等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞多为贴壁细胞将刚分散的细胞转移至培养瓶后待4-5h后观察细胞贴壁情况此时可更换新的培养基除去未能贴壁的细胞碎片及死细胞。每日观察细胞生长增殖情况待细胞贴壁密度大于90%时可用胰酶消化按1:5比例进行传代到新的培养瓶或培养板上可根据需要适当调整接种比例或者取适量消化后进行其他细胞实验。成纤维细胞的排除成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。机械刮除法：是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：标记：镜下观察用记号笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；刮除：弃掉培养液把无菌胶刮伸入瓶皿中肉眼或显微镜窥视下刮除无标记空间；用Hanks液/PBS缓冲液冲洗一两次洗除被刮掉的细胞；注入培养液继续培养如发现仍有成纤维细胞残留可重复刮除至完全除掉为止反复贴壁法：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点并结合使用不加血清的营养液把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁使两类细胞相互分离操作方法与传代相同。待细胞生长达一定数量后倒出旧培养液用胰酶消化后Hanks/PBS缓冲液冲洗2次加入不含血清的培养液吹打制成细胞悬液；取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后轻轻倾斜培养瓶让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；培养B瓶中细胞5～20分钟后接处理A的方法把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。当三个瓶内都含有培养液后均在温箱中继续培养。如操作成功次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞B瓶两类细胞相杂C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次直至癌细胞纯化为止。消化排除法：先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次然后再换成新的混合液继续消化并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶到半数细胞脱落下来后便立即停