最新精编医学专题—真核细胞常见表达载体.docx

真核细胞常见表达载体真核细胞表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在转染细胞后用G418筛选可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。2、pEGFP增强型绦色荧光蛋白表达载体(EnhancedFluorecentProteinVector)特点:pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白在PCMV启动子驱动下在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点将外源基因扦入这些位点将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子Acet1-Nhe1)。3、pEGFT-Actin增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因在PCMV启动子驱动下在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途:pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。4、pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是该表达载体不含有neo基因转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。其他常用克隆Vector：pBluscriptIIKSDNA15ugpUC18DNA25ugpUC19DNA25ug说明:pBluescriptIIkS、pUC18&Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点当外源DNA片段扦入转化lacZ基因缺乏细胞并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。此外这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。保存液:TEBufferTEBuffer组成:10mMTris.HCL(Ph8.0)1mMEDTA用途:克隆外源DNA片断.进行基因表达.使用M13、T7和T3引物进行测序.存在的问题细胞的生命活动是一个复杂的调控过程有些生命活动的机理还不完全清晰由于插人的目的基因不同载体构建栗用的顺式组件不同组装的空间位置不同采用的表达系统不同目的基因表达水平和阳性克隆筛选率都会有很大差异。另外由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性所构建的高效表达载体不一定在所有细胞株中均高效表达。再者细胞生长状态的差异转染方法的不同培养时阉的长短筛选药物浓度的高低对表达量都有很大影响。所以需要综合评价一个表达载体和表达系统排除一些不定因素筛选出最佳组合真核表达载体趋向于既有利于扩增目