口腔内科论文口腔上皮细胞论文：口腔黏膜上皮细胞体外培养的影响因素分析及改进方法.doc

口腔内科论文口腔上皮细胞论文：
口腔黏膜上皮细胞体外培养的影响因素分析及改进方法
[摘要]目的分析人口腔黏膜上皮细胞培养的影响因素，并建立稳定的细胞培养体系。方法新洁尔灭和硫酸庆大霉素联合处理口腔黏膜标本，比较不同浓度的Dispase对上皮的分离作用，酶消化法分离细胞，采用无血清培养液进行原代和传代培养。结果微生物污染得到有效控制，0.40%的Dispase的上皮分离效果优于0.25%的Dispase，细胞在短期内快速稳定增殖。结论人口腔黏膜上皮细胞的原代培养方法经改进后可简化操作，并提高成功率。
[关键词]细胞培养；口腔黏膜；上皮细胞
人口腔黏膜上皮细胞的体外培养对于研究口腔黏膜上皮细胞的生理、病理变化，上皮癌变过程以及组织工程化黏膜的构建具有重要意义。多年来，国内外许多学者一直致力于获得更为完善有效的口腔黏膜上皮细胞的培养体系。但是微生物的污染、人类黏膜组织来源的限制、上皮细胞不能贴壁以及所需营养成分复杂等仍然是上皮细胞培养成功的主要影响因素[1]。本研究对这些影响因素进行分析，试图通过培养体系的改进而探索更好的口腔黏膜上皮细胞的体外培养方法。
1材料和方法
1.1组织来源
2004年10月—2005年6月于吉林大学口腔医院口腔颌面外科取唇裂修复术、智齿拔除术和鳞癌手术切除的口腔黏膜正常组织24例，患者年龄6个月～76岁。其中，鳞癌患者的正常黏膜取自手术切除组织的边缘，并经病理切片证实无上皮异常增生，也未发生癌变。
1.2主要试剂
分离酶Dispase和角化细胞无血清培养液（keratinocyte-serumfreemedium，K-SFM）（Gibco公司，美国）；胰蛋白酶（上海生物工程有限公司）；胎牛血清（天津灏洋）；鼠抗人广谱单克隆角蛋白抗体AE1/AE3及SP免疫组化试剂盒（福州迈新）；其余试剂均为国产分析纯。
1.3主要仪器和器材
CO2饱和湿度细胞培养箱（Napco公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；超净工作台（苏州净化设备厂）；一次性细胞培养板和培养皿（NUNC公司，丹麦）；0.22μm微孔滤器（Corning公司，美国）。
1.4方法
1.4.1标本处理无菌条件下所取的口腔黏膜组织立即保存于D-Hank′s液中，半小时内运送至细胞培养室。超净台内组织标本经PBS洗净血迹，0.06%的新洁尔灭（苯扎溴铵）溶液浸泡2min，再用含有硫酸庆大霉素的PBS（2g/L）依次浸泡10min、3min和2min。处理后的标本经眼科剪剪去部分黏膜下组织，并修剪成0.3cm×0.8cm大小的组织块。
1.4.2黏膜上皮的分离所有黏膜组织被随机分为2组。一组黏膜标本放入0.25%的Dispase中，另一组黏膜标本放入0.40%的Dispase中，2组均置于4℃下消化22h。取出后用眼科镊分别夹持标本的上皮层和上皮下层，将上皮分离下来，弃去上皮下层。经3位实验者完成操作，并一致确认每例标本上皮分离的结果，评判标准如下。①有分离作用：标本的上皮被完整或部分分离下来；②完整分离作用：每块标本的上皮均被完整分离下来；③无分离作用：每块标本的上皮均不能分离下来。分别记录每组有上皮分离作用的例数，计算分离率。分别记录每组有完整分离作用的例数，计算完整分离率。比较2组分离率和完整分离率。
1.4.3上皮细胞的培养原代培养方法：上皮经PBS冲洗后加入到0.125%胰蛋白酶与0.01%EDTA（1∶1）的混合消化液中37℃下消化5～10min（2min振荡1次），轻轻吹打，用含10%胎牛血清的D-Hank′s液终止消化，用吸管吹打成细胞悬液，经200目无菌尼龙滤网过滤。PBS洗涤2遍，离心500r/min×10min。细胞沉淀在K-SFM中重悬，血球计数板计数。细胞悬液以2.5×105个/cm2的密度接种于培养板中，置37℃5%CO2细胞培养箱中静置培养。第3天首次换液，培养液移入新孔中使未贴壁细胞继续贴壁。以后隔天换液1次。
传代培养方法：当细胞达到80%～90%汇合时，吸去培养液，0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA（1∶1）的混和消化液消化细胞，至镜下观察细胞突起回缩，细胞变圆时终止消化，吸管反复吹打，离心800r/min×8min，K-SFM重悬细胞沉淀，细胞悬液以1∶2的比例接种于培养板或培养皿中继续培养，以后隔天换液1次。
1.4.4细胞形态学观察采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长增殖情况并拍摄照片。
1.4.5免疫细胞化学染色取第2代细胞制细胞爬片，PBS洗涤3次后，4%的多聚甲醛溶液固定30min，0.3%Trtion-100室温下处理10min。用广谱单克隆角蛋白抗体及SP免疫组化试剂盒按试剂盒说明书进行免疫组化染色。以正常口腔黏膜组织石蜡切片为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。
1.5统