鸡胚成纤维细胞的制备.doc

鸡胚成纤维细胞的制备
一、材料和试剂1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等
二、操作步骤
1、操作前的准备：
eq\o\ac(○,1)预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
eq\o\ac(○,2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
eq\o\ac(○,3)正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
eq\o\ac(○,4)点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
eq\o\ac(○,5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
eq\o\ac(○,6)取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2、成纤维细胞制备：
=1\*GB3①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。
=2\*GB3②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。
=3\*GB3③再用PH7.2的PBS冲洗两次。
=4\*GB3④用镊子捏成小块（2-3mm3）,用PH7.2的PBS冲洗两次。
=5\*GB3⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。
=6\*GB3⑥期间配制细胞培养液：
培养基：MEM
双抗：2%
7.5%碳酸氢钠：2%
牛血清：6%
3%谷氨酰胺：1%
=7\*GB3⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。
=8\*GB3⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。
=9\*GB3⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。
=10\*GB3⑩重复步骤=9\*GB3⑨的操作重虑一遍。
eq\o\ac(○,11)计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。
eq\o\ac(○,12)分装置个培养瓶中（7-8ml/瓶），置37℃培养箱培养。

样品的接种
一、材料和试剂1、细胞：贴壁细胞株2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶，1.5mlEP管，酒精棉球，废液缸等二、操作步骤
1、接种前准备：
eq\o\ac(○,1)预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
eq\o\ac(○,2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
eq\o\ac(○,3)正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
eq\o\ac(○,4)点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
eq\o\ac(○,5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
eq\o\ac(○,6)取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
eq\o\ac(○,7)从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
eq\o\ac(○,8)打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
２、接种：
eq\o\ac(○,1)待成纤维细胞长成单层后（一般是在制备后２４小时），无菌取出要用的五个方瓶，设置成三组实验组两个，空白对照组一个，阳性对照组两个；倒掉原有的细胞培养液，用ＰＨ
７.２的无菌ＰＢＳ洗一遍，再按照如下表格分组，加样。
分组空白对照组实验组阴性对照１１２１２加样０.４ml培养液０.４ml样品０.４ml样品０.４ml病毒液０.４ml病毒液条件3７℃孵育30min，期间15min轻摇一次=2\*GB3②待孵育完成后倒掉接种液，加细胞生长液８ml／瓶，放入3７℃培养箱培养，次日更换维持液。