HLPP1对小鼠脊髓损伤运动功能恢复的实验研究.doc

·中文论著摘要·沉默PHLPP1对小鼠脊髓损伤运动功能恢复的实验研究目的研究PHLPP1沉默后对小鼠脊髓损伤的影响和对神经元凋亡的调控作用。方法以PHLPP1为目的基因的小干扰RNA（siRNA）与携带荧光素蛋白的腺病毒载体重组（AdsiPHLPP1）分别对脊髓注射和神经元转染在体内和体外创建PHLPP1沉默模型。1、选取18-23g的成年小鼠随机分为：假手术组（仅椎板切除）、脊髓损伤组（Allen’s法建立脊髓挫伤模型）、沉默组（脊髓注射AdsiPHLPP1）和沉默脊髓损伤组（脊髓注射AdsiPHLPP1后行Allen’s法）。2、体外培养脊髓神经元建立H2O2诱导的细胞损伤模型分为：对照组、H2O2损伤组、沉默组（细胞经AdsiPHLPP1转染）和沉默损伤组（细胞经AdsiPHLPP1转染后行H2O2处理）。通过Westernblot技术分别检测体内外实验各组的凋亡相关蛋白和神经营养因子的表达；BMS评分观察损伤后28天内不同处理组中的小鼠运动功能恢复情况；同时通过Nissl染色观察各组脊髓前角运动神经元存活的数量。结果通过免疫荧光和Westernblot技术检测到AdsiPHLPP1成功作用于神经元并有效的使PHLPP1的表达减少。而且沉默PHLPP1可减少脊髓损伤后Nrf2的表达同时经AdsiPHLPP1处理的组织和细胞在损伤后均可诱导促凋亡因子(Baxandcleaved-caspase3)的表达并降低神经营养因子(BDNF)和抗凋亡因子(Bcl-2)的表达。此外注射AdsiPHLPP1小鼠的后肢运动功能比野生型（WT）小鼠恢复得更慢同时脊髓损伤后前角存活的运动神经元的数量也降低。结论PHLPP1的沉默促进脊髓损伤后神经元的凋亡并抑制运动功能恢复。关键词PHLPP1；神经元凋亡；Nrf2；脊髓损伤·英文论著摘要·ExperimentalstudyonthefunctionalrecoveryofspinalcordinjuryinmicebyPHLPP1silenceObjectiveMethodsResultsConclusionKeywords·英文缩略语表··论文·沉默PHLPP1对小鼠脊髓损伤运动功能恢复的实验研究前言脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤性疾病可导致损伤节段面以下的肢体功能障碍且具有高度伤残性和死亡率。脊髓损伤通常包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是指外界暴力直接作用于脊髓引起脊髓损伤不可逆的修复；继发性损伤是在原发性损伤基础上引起的一系列生化反应包括氧化应激炎症反应和神经元凋亡的增加[1-3]。目前临床上对脊髓原发性损伤尚无有效的治疗措施当前对脊髓损伤的治疗主要集中在改善继发性损伤引起的脊髓内部微环境的变化所以寻找一个可以缓解继发性损伤病理生理过程的靶点将是治疗脊髓损伤新途径。PH结构域及富含亮氨酸的重复序列蛋白磷酸酶（PHLPP）属于Ser/Thr蛋白磷酸酶家族能够使下游具有Ser/Thr结构的蛋白磷酸化从而调控其活性；PHLPP家族主要包含两种亚型：PHLPP1和PHLPP2目前主要对PHLPP1在各领域的研究较广泛[4-6]。研究发现PHLPP1在成年小鼠的海马神经元中表达且能够发挥保护作用[7]。近年来在结直肠癌[8-9]和乳腺癌[10]中发现PHLPP1表达上调可以促进肿瘤细胞的凋亡并抑制肿瘤细胞的侵袭能力及分化能力从而发挥抗肿瘤作用。同时在脑缺血模型中发现PHLPP1基因缺失起保护作用[11]。研究证实由于神经元的凋亡是不可逆修复并阻断神经营养因子的传导故神经元凋亡在加速脊髓继发性损伤中起重要作用是影响运动功能恢复的主要原因之一[12-13]。核因子E2相关因子2（Nrf2）是一种转录因子在静息状态下与细胞质中的Kelch样ECH相关蛋白（Keap1）紧密结合[14]；当机体受到损伤时Nrf2与Keap1发生解离从细胞质中释放到细胞核成为活性状态同时激活其下游的靶蛋白血红素加氧酶-1（HO-1）在损伤的神经元细胞中发挥抗氧化应激作用减少神经元的凋亡[15-17]。PHLPP1和Nrf2在神经元中都能够调节细胞的凋亡。然而目前仍不清楚在脊髓损伤后PHLPP1是否通过影响Nrf2的表达来调节神经元凋亡。因此本研究利用AdsiPHLPP1在体内外建立PHLPP1沉默模型并观察PHLPP1沉默对脊髓损伤发展的作用以及是否通过影响Nrf2的表达来调控神经元凋亡并可能为脊髓损伤的治疗提供一个新的基因靶点。实验材料与方法一、实验材料（一）实验动物健康成年小白鼠(18-23g)购买并饲养于锦州医科大学SPF级实验动物中心所有动物实验操作都遵循美国国家卫生研究院的实验动物伦理指南。