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大蒜中SOD活性的测定

一、实验目的：
（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
（3）掌握离心机的使用。
二、实验原理:
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。
三、实验试剂：
大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL3个、500mL3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根
四、实验步骤：
（1）SOD提取：
称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.80.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)
（2）除杂蛋白：
提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）
（3）SOD酶的沉淀分离：
剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL备用，其余量取体积。
（4）粗酶液活性测定：
提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。
试剂/（mL）空白管对照管OD1提取液OD2粗酶液OD2酶液OD2PH8.3缓冲液33333SOD提取液000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.2（5）溶液中可溶性蛋白含量测定：
分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。
提取液稀释：50×
粗酶液稀释：20×
酶液稀释：10×
五、实验数据：

提取液粗酶液酶液总体积（ml）
提取液粗酶液酶液260nm吸光度值280nm吸光度值公式蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280－0.74A260)×稀释倍数蛋白质浓度（mg/ml）
对照管（OD1）提取液（OD2）粗酶液（OD2）酶液（OD2）420nm吸光值六、实验结果及数据处理：
（1）酶活力单位
提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=
粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=
酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=
（2）总活力
提取液总活力U=活力单位×总体积=
粗酶液总活力=活力单位×总体积=
酶液总活力=活力单位×总体积=
（3）比活力
提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=
粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=
酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=
（4）纯化倍数
粗酶液纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=
酶液纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=
（5）回收率
粗酶液回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=
酶液回收率=酶液总活力/提取液总活力=
七、实验结果误差分析：
（1）研磨和离心大概还不够充分。
（2）由于测量仪器的精密度引起的误差。
（3）在操作的过程中，加入邻苯三酚后未混合均匀，可能致使化学反应进行得不很充分，这可能是造成实验数据与预期不符的一个原因；
（4）在实验过程中，所需化学试剂加入的量不是很准确，这可能是实验数据出现问题的另一个原因；
（5）此外，实验本身还很粗糙，酶的提取、分离和纯化都不能十分彻底，还有很多杂蛋白干扰实验。

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