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214中国医药生物技术2008年6月第3卷第3期ChinMedBiotechnol,June2008,Vol.3,No.3

·综述·
蛋白质和多肽的N端测序技术研究进展

赵丽艳，张养军，钱小红

氨基酸序列测定是了解蛋白质性质和功能的重要途径，团的方法，例如用蛋白酶去除N端焦谷氨酸和通过酸催化
N端区域又是蛋白质及多肽重要的结构和功能部位，其序的亲核取代去除N乙酰化丝氨酸和N乙酰化苏氨酸残
列特异性很高，通过N端的少数几个氨基酸残基就可以对基[12]等，但都只适于一定残基的特定修饰，没有普遍适用
大多数蛋白质进行鉴定[1]。例如，可以通过对蛋白质和多肽性，且许多末端残基修饰是无法移去的；③不适于高通量分
类药物的N端进行人工修饰（如环化修饰、甲基化修饰析，灵敏度不够[13]。但是Edman降解对于整体纯化的蛋白
等），提高其降解稳定性延长药效[2-3]。因此N端肽段的鉴的N端序列分析仍是很有价值的研究工具。
定具有非常重要的意义，本文对近年来蛋白质和多肽N端人们还利用RT-PCR从编码蛋白质的mRNA得到其
测序技术及方法进行了综述。cDNA序列，再根据遗传密码表反推出其相应的氨基酸序
列。20世纪80年代出现了从基因组中找出编码蛋白质的
1蛋白质和多肽N端的重要生物学功能基因，测定其DNA序列，再反推出蛋白质的氨基酸序列
所有蛋白质合成都起始于N端，其序列组成对其生物的技术。其特点是更加简便、快速，但利用RT-PCR或测
学功能有着巨大的影响。①蛋白质的半衰期与N端氨基酸定基因组的碱基序列也不能完全描述蛋白质的一级结构，它
的特异性有关，或者说N端氨基酸残基对蛋白质的寿命有对翻译加工所导致的氨基酸残基的修饰及突变等情况无能
控制作用[4]；②N端序列与蛋白质的亚细胞器定位有密切关为力。
系，例如，某些特殊的氨基酸序列可以作为蛋白质分选标记2.2质谱技术
影响蛋白质定位[5]；③蛋白质的N端可发生许多种翻译后质谱（MS），尤其是电喷雾（electrasprayionization，
修饰，影响其结构和功能。如在新生肽链的成熟过程中，2/3ESI）和基质辅助激光解吸电离-飞行时间（matrix-assisted
的叶绿体蛋白质会发生起始甲硫氨酸残基的剪切和前导肽laserddesorption/ionizationtime-of-fight，MALDI-TOF）的出
的去除[6]；又如核心组蛋白N端赖氨酸的可逆乙酰化修饰现，使质谱技术在蛋白质结构分析中的应用发生了革命性的
使组蛋白与DNA间的作用减弱,导致染色体局部解旋，促飞跃。高灵敏度、高准确性、高分辨率和高通量的生物质谱
进基因转录，而去乙酰化则抑制基因转录[7]。这种乙酰化和技术为蛋白质的N端测序提供了一种重要的选择。
去乙酰化过程中的任何异常都会导致生长、发育的紊乱,诱2.2.1阶梯式测序是间接肽序列测定技术[14]，通过末端
发白血病、皮肤癌等疾病[8]。因此，通过对蛋白质N端序酶解或化学降解产生一组相互之间仅差一个氨基酸残基的
列的研究有利于分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物多肽系列，经MALDI-TOFMS鉴定后，根据所得到的肽
学功能。阶梯图中各肽段的相对分子质量差值确定末端的氨基酸序
列，从而用于数据库查询。阶梯测序是最早探索用质谱进行
2蛋白质和多肽N端测序技术蛋白质测序的例子[15]，经过几个Edman反应循环的肽段混
2.1非质谱技术合物被MALDIMS检测，原始肽段的序列就可从质谱测得
1955年，FrederickSanger采用二硝基氟苯（FDNB）的梯形序列里得到阐明。另外，Zhong等[16]还提出了质谱
法，首次成功地完成了第一个蛋白质——牛胰岛素的序列分结合微波辅助酸水解的阶梯式测序方法，通过25%的三氟
析。在此测序方法的基础上，瑞典有机化学家Edman[9]提乙酸溶解蛋白质，用普通微波辐射10min后，用质谱直接
出了蛋白质N端顺序测定方法——Edman降解。之后随着检测其酸水解的梯度产物进行蛋白质序列的分析。
基于此原理的液相、固相及气相自动蛋白质序列分析仪的推2.2.2化学标记结合质谱许多对末端肽的研究方法采用
出和逐步完善，经典的Edman降解法已经广泛应用于蛋白的是质谱技术与多种化学方法及生物酶法的结合，通过N
质的N端测序。Chen等[10]在微流控芯片上进行Edman端的各种化学标记，运用MS/MS或多级质谱（MSn）的碰
反应，使得肽段测序的灵敏度提高到亚飞摩尔水平；并利用
Edman反应2次循环得到肽段的串联质谱（MS/MS）图的基金项目：国家自然科学基金（20505018，20635010）；国家高技术研
[11]究发展计划（863计划）（2006AA02A312）；国家重点基础研究发展规
b2离子为内标，获得