兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定.pdf

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兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定输和代谢，催化内源性化合物的水解旧J。羧酸酯酶·论著·文章编号：1007—8738(2009)06—0516—03朱晓美1，李淑珍1，吴春铃1，包红霞1，朱大岭2，唐晓波件(哈尔滨医科大学药学院：1生物制药学教研室；：生物医药人羧酸酯酶1(human1，hCESl)是羧酸酯酶亚家族中的重要成员之一，是相对分子质量(肘，)为180ooo的三聚体酶⋯。其基因产物定位于许多组织的内质网，主要分布于肝脏中旧J。该酶能有效地催化包括酯和酰胺基的多种药物和前体药物的水解生成相应的自由酸和醇，与多种药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢有关，并参与脂质运不足可能伴有非霍奇金氏淋巴瘤或B细胞淋巴细胞白血病。最近研究表明，hCE可作为肝癌的新标志物HJ。本实验室已研制出抗人CES2的单克隆抗体∞J。国外已研制出抗CESl的抗体，国内尚无这方面报道。我们主要从构建重组表达载体人手，获得其融合表达蛋白后，免疫新西兰雄性大耳白兔，制备抗hCESl多克隆抗体，并对抗体进行特性鉴定，为进一步研究CESl的功能、前体药物的设计及其在肝癌等癌症的诊断和治疗中的作用提供了工具。1材料和方法皮下多点免疫融合蛋白400懈。2周后加强免疫，2次加强免min，弃沉淀后滤膜(0．22岬1)过滤，加入1／10体积的10×PBS，用0．1咖l／L!墅盟!鲤Z=12≥!缕咆生坌王鱼蕉：羔鍪盛(gbi旦』鱼!!丛!!!堡塑!旦!12兰塑!：至皇(盟工程莺点实验窜一省部共建国家苇点实验窜，黑龙江哈尔滨150081)[摘要]目的：制备兔抗人羧酸酯酶1(CESI)多克隆抗体(pAb)，并对抗体进行特性鉴定。方法：以人正常肝eDNA文库为模板，构建重组表达质粒pGEX一4T-1一CESI(即CESI-GST)和pET-32a．CESI(即CESI—His)。CESI—GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb，辛酸一硫酸铵法纯化抗体，采用Westernblot和免疫组化鉴定抗体的特异性。结果：CESl-GST和CESI．His融合蛋白均在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达。兔抗人CESIpAb效价为1：64blot鉴定表明，该抗体可识别重组人CESl蛋白，也可特异地识别人肝微粒体中的CESl亚基。免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性识别正常肝组织中的CESI蛋白。结论：成功地制备了兔抗人pAb，该抗体可应用于ELISA、Westernblot、免疫组化等实验，为进一步研究CESl的功能提供了特异性检测工具。[关键词]CESI；重组蛋白；多克隆抗体[中图分类号]R392．1l[文献标识码]B1．1材料成人肝cDNA文库购自Clonetech公司。大肠杆菌BL21感受态菌株、人肝脏微粒体蛋白为本实验事自制。雄性大耳白兔6周龄，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。pGEX一4T一1和pET-32a为Amersham公司产品。限制性内切酶EcoRI和XhoI、ExTaq酶、T4连接酶等购自TaKaR且公司。PCR回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OmegaBiotek公司。福氏佐剂及3，3，5，5-plj甲基联苯胺(TMB)均购自Sigma公司。HRP-山羊抗兔IgG购自JacksonImmunoReseareh公司。牛血清白蛋白(BSA)购自Solarbio公司。蛋白酶抑制剂购自Roche公司。硝酸纤维素膜(NC)购自BIO—RAD公司。ECLPlus购自Ame瑙hamBiosciences公司。即用型二步法(非生物素)检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1．2方法CESI抗原的制备和纯化根据HumanDatabase中提供的CESI的氨基酸序列，并结合应用生物信息学软件DNAstar的表位分析，综合设计引物。在其上游引物设计EcoRI酶切位点，下游引物设计XhoI酶切位点，片段全长438个碱基，以人正常肝cDNA文库为模板进行PCR反应。回收扩增目的片段，并将目的片段及pGEX-4T-1和pET-32a载体分别经EcoRI双酶切并连接，转化入大肠杆菌，阳性克隆经测序iF确后抽提质粒，进行诱导表达。CF_S1在BL21细菌中以包涵体形式表达，收集蛋白并进行纯化。兔抗人CESl多克隆抗体的制备将纯化的CESI．GST融合蛋白和等体积福氏完全佐剂充分混合后，每只家兔疫后7d，经耳缘静脉采血测定抗体的效价符合要求，注射lag抗原冲击免疫后3d颈动脉采血，分离血清，分装后置一20℃保存。辛酸-硫酸铵法纯化抗体用醋酸钠缓冲液(60pH4．0)将抗血清稀释3—4倍，0．1NaOH调节pH至4．5，缓慢滴加辛酸至浓度为25mL／L，室温搅拌30g离心30NaOH调节pH至7．4，缓慢加人预冷的饱和硫酸铵至45％饱和度，混合后4。C过夜。4。Cmin，弃上清后，用0．01