人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定.pdf

http://www.paper.edu.cn
人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定1

戴文达，方涛林，李熙雷，林红，董健，陈峥嵘

复旦大学附属中山医院骨科，复旦大学上海医学院外科学系，上海（200032）

Email：[e-mail]

摘要:目的探索一个高效分离和扩增人骨髓间充质干细胞的方法，并通过形态学和多向分
化能力进行鉴定。方法抽取人胸椎骨髓标本，联合利用密度梯度离心和差异贴壁法分离
MSCs，体外扩增后传代，相差显微镜形态学观察和流式细胞仪检测细胞表面标记CD13、CD29、

HLA-2、CD34、CD45和HLA-DR。在地塞米松、左旋VitC、β-磷酸甘油、FK506作用下向成骨
细胞诱导分化；在TGF-beta3、重组人胰岛素、丙酮酸钠、亚硒酸等作用下向软骨细胞诱
导分化；在地塞米松、IBMX、吲哚美辛的作用下向脂肪细胞诱导分化；在VEGF、bFGF作用
下向血管内皮细胞分化。结果原代和传代细胞呈梭形外观，生长增殖能力良好。细胞表面
标记物CD13、CD29，HLA-2阳性，CD34、CD45和HLA-DR阴性。经定向诱导分化后，细胞分
别呈现成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞的表型特征。结论该方法能从人骨
髓中高效分离和扩增MSCs，能成功定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮
细胞。

关键词:骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞分化；组织工程

中图分类号:Q813

1本课题得到973项目（骨骼、周围神经损伤修复机制与措施和重度脑创伤救治研究，2005CB522600），教
育部博士点基金（HIF-1α/VP16嵌合基因转染促进大块人工骨中心区域的微血管化，20060246074）资助

-1-
http://www.paper.edu.cn

1．引言

干细胞是目前生命科学的研究热点。骨髓间充质干细胞(BoneMarrowDerived
MesenchymalStemCells，MSCs）因其自身所具有的特殊性而日益受到人们的关注。MSCs
最早由Friedenstein发现，具有多向分化潜能，在特定的条件下可分化为成骨细胞、成软骨
细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞等多种中胚叶来源组织细胞[1-3]；而
且MSCs特性稳定，易于获得及扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能[4]。在
组织工程中具有良好的应用前景。人体骨髓中MSCs含量稀少，仅占单个核细胞的百万分之一
到十万分之一。而组织工程需要大量的种子细胞，故需进行体外纯化和扩增。本实验研究人
MSCs的体外分离、纯化、扩增以及定向分化条件，为MSCs的临床应用提供理论依据和技术方
法。

2．材料和方法

2.1主要试剂和仪器

低糖DMEM培养基(Gibco,USA)，优等胎牛血清(Hyclone,USA)，Percoll（1.073×10-3g/L,
Sigma,USA），青霉素G钠，硫酸链霉素，两性霉素B（GIBCOBRL,LifeTechnologies,USA），
地塞米松，β-甘油磷酸，左旋维生素C（Sigma,USA），FK506(FujisawaPharmaceutical
Co.,Ltd,Japan)，丙酮酸钠（Sigma,USA），TGF-beta3（R&DSystems,Inc.USA），重
组人胰岛素（优沁林®常规，中国礼来公司），转铁蛋白，亚硒酸，牛血清白蛋白，亚油酸
（Sigma,USA），IBMX（1-甲基3-异丁基-黄嘌呤）（Biosource,USA），吲哚美辛（Cayman
Chemical,USA），油红O（Sigma,USA），抗CD29、CD44、CD34及CD45单克隆抗体(Sigma)，
VEGF，bFGF，Ⅰ、Ⅱ型胶原抗体（SIGMA,USA），生物素化二抗（DAKO,DENMARK），培养
板、培养瓶（Cornig,USA）。

2.2HBMSCs的分离与培养

经患者知情同意，自男性24岁胸椎骨折病人健康椎体取得骨髓10mL，肝素抗凝后Percoll
（1.073×10-3g/L）密度梯度离心，取中间单核细胞层以低糖DMEM洗涤2次，接种入75cm2培

养瓶（Cornig,USA），以含10%FBS，100units/mL青霉素G钠，100μg/mL硫酸链霉素，
0.25μg/mL两性霉素B的低糖DMEM培养。24h后换液，弃未贴壁的细胞，剩余的贴壁细胞主
要是MSCs[5]。以后每2~3天换液，待细胞生长至90%汇合后胰蛋白酶消化传代。

2.3人骨髓MSCs的生长曲线测定

以原代、第4代和第14代细胞为标本，制备单细胞悬液,调整密度为4×104个/mL，接种
于24孔培养板,每