基因工程产物的分离纯化.doc

基因工程产物的分离纯化.txt11生命是盛开的花朵，它绽放得美丽，舒展，绚丽多资；生命是精美的小诗，清新流畅，意蕴悠长；生命是优美的乐曲，音律和谐，宛转悠扬；生命是流淌的江河，奔流不息，滚滚向前第二节选择分离纯化方法的依据

一、根据产物表达形式来选择

分泌型表达产物的发酵液的体积很大、但浓度较低，因此必须在纯化前进行浓缩，可用沉淀和超滤的方法浓缩。

二、根据分离单元之间的衔接选择

应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效的分离手段，先将含量最多的杂质分离去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段，即通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白类杂质）；随后采用高分辨率的操作单元（如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱）；凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可以提高分离效果。

三、根据分离纯化工艺的要求来选择

在基因工程产物分离纯化过程中，通常需要综合使用多种分离纯化技术，一般来说，分离纯化工艺应遵循以下原则：

（1）具有良好的稳定性和重复性；
（2）尽可能减少组成工艺的步骤；
（3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调；
（4）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质量；
（5）分离纯化工艺所用的时间要尽可能短；
（6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低。
（7）具有较高的安全性。

第一节基因工程产物分离纯化技术

基因工程初产物具有下列特点：
①目的产物在初始物料中含量较低；
②含目的产物的初始物料组成复杂；
③目的产物的稳定性差；
④种类繁多；
⑤应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等。
为了获得合格的目的产物，必须建立与上述特点相适应的产品分离纯化工艺。
分离纯化技术应满足下列要求：
①技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；
②选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；
③收率要高；
④两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整；
⑤整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的需求。
一、细胞破碎与固液分离

以大肠杆菌为宿主的基因工程产物多为胞内产物，分离提取这类物质时，需经细胞收集、细胞破碎和细胞碎片分离等步骤。

（1）细胞收集常用离心分离的方法；膜过滤法也逐渐得到广泛应用。
（2）细胞破碎有机械破碎法和非机械破碎法。可以根据生产规模和活性蛋白质在细胞中的位置，选择适当的方法。
机械破碎法是常用的方法，速度快，处理量较大，不会带入其他化学物质；但在处理过程中要产生热量，必要时要采取冷却措施，以防止目的产物失活。常用方法有：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法。
非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。
（3）固液分离分离细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配的方法，使细胞碎片分配在一相（通常为下相）而分离，同时也起部分纯化作用。离心沉淀是固液分离的主要手段，包括高速离心和超速离心。常用的膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等。
二、目的产物的分离纯化

分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是基因工程下游精制阶段的常用手段，该法优点是具有多种多样的分离机制，设备简单，便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱等。

三、非蛋白质类杂质的去除

非蛋白质类杂质不应忽视，在纯化过程中，需要特别注意3种可能存在的非蛋白质类杂质，它们是DNA、热原质和病毒。