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第35卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第2期

2007年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry285～288

几种常用荧光探针的化学发光成像研究

侯凌燕章竹君*周福林
(陕西师范大学化学与材料科学学院,西安710062)

摘要利用双(2,4,6)三氯苯基过氧化草酸酯(TCPO)-过氧化氢(H2O2)-咪唑-荧光探针的化学发光体系,
研究了荧光探针化学发光成像,对几种常用的荧光探针(丁基罗丹明、罗丹明B、罗丹明6G、荧光素及异硫氰
酸荧光素等)进行了定量分析。本方法具有高灵敏度、成像分析高通量等优点,线性范围宽,检出限达10-11
mol/L。对四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的单克隆羊抗人IgG的化学发光成像分析,比相同条件下荧
光成像的检出限低一个数量级。

关键词荧光探针,化学发光成像,化学发光
1引言

探针是一种能和某特异靶分子相互作用,实现对靶分子进行检测的分子,并要求相互作用后对被探
测对象不产生或仅产生可忽略的干扰。荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长光的激发
[1～3]
下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。目前常用
的荧光探针有荧光素类探针、无机离子荧光探针、荧光量子点、分子信标等。荧光探针除应用于核酸和
蛋白质的定量分析外,在核酸染色、DNA电泳、核酸分子杂交、定量PCR技术以及DNA测序上都有着广
泛的应用[4,5]。
目前,检测荧光探针的方法主要有单点测定和电荷耦合装置(CCD)荧光成像(包括用于微区分析
的激光共聚焦荧光显微镜成像)。由于光电倍增管点扫描时间较长,激光照射强度高,很难抓住荧光早
期变化。而CCD荧光成像的面阵大,成像视野广,成像时间可以调节,因而检测效果比较好[6～9]。
化学发光检测的最大特点是设备简单、操作简便、分析速度快及灵敏度高。化学发光成像分析
(CLI)是将化学发光与成像技术相结合,从而具有分辨率高、多样品同时检测、光谱响应范围宽以及灵
敏度高等特点[10,11],已广泛应用于凝胶、蛋白印记及微阵列芯片中的化学发光信号检测[12]。本实验建

立了TCPO-咪唑-H2O2-荧光探针化学发光成像体系。由于化学发光不需要任何光源,因而在对荧光探
针进行化学发光成像检测时,不存在荧光检测或者荧光成像时不可避免的光学背景的干扰,从而可以获
得更低的检出限。用此体系对5种荧光探针进行定量分析,并研究了用四甲基异硫氰酸罗丹明
(TRITC)标记的单克隆羊抗人IgG的化学发光成像,检出限达10-11mol/L,比相同条件下荧光成像的检
出限低一个数量级。
2实验部分

2.1仪器和试剂
带有冷却CCD装置的FluorChemTMIS-8800发光成像分析仪(美国AlphaInnotech公司);Windows
2000系统中的AlphaEaseFC软件。
-2
5×10mol/LTCPO(自制)的乙腈(天津市化学试剂六厂)溶液;1.0mol/LH2O2乙腈溶液;
1×10-2mol/L咪唑(天津市远航化学品有限公司)乙醇(西安化学试剂厂)溶液;4mg/L标记TRITC的

单克隆羊抗人IgG(美国SantaCruzBiotechnology公司)乙醇溶液;0.1mol/LNaCO3-NaHCO3(西安化学
试剂厂)抗体包被液(pH9.6);1×10-2mol/L荧光素、罗丹明B、罗丹明6G、异硫氰酸荧光素(FITC)和

2006-02-28收稿;2006-10-22接受
本文系国家自然科学基金资助项目(No.30470886)
*E-mail:[e-mail]
286分析化学第35卷

丁基罗丹明(西安化学试剂厂)的乙醇溶液。以上溶液使用时再用相同溶剂稀释成所需分析溶液。所
有试剂均为分析纯。水为离子交换水,再经石英蒸馏器亚沸蒸馏制得。
2.2实验方法

用微量加样器依次加入荧光探针分析液、H2O2溶液(含咪唑)、TCPO溶液各50μL于96孔板中,轻
轻震荡30s,放入FluorChemTMIS-8800发光成像分析仪的检测箱中,10s后开始以图像形式记录化学发
光信号,积分时间为5min。利用Windows2000操作系统中的AlphaEaseFC软件记录并处理所得结
果,发光强度用平均光密度值AVG(averagevalue)统计,并扣除背景值。
3结果与讨论

3.1实验溶剂的选择

在TCPO-H2O2-咪唑-荧光探针体系中,溶剂的选择对于TCPO发光强度以及检出限具有很大的影
响。荧光物质用水作溶剂时,反应体系的溶剂、水含量、反应物浓度、催化剂、pH值等对反应产生了不同
程度的影响[6]。在pH8.5的水相缓冲环境中能获得最大发光信噪比,且研究