功能基因的克隆及生物信息学分析.docx

编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径学海无涯苦作舟页码：功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要：随着多种生物全基因组序列的获得基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]它代表了基因分析的新阶段已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物发展和应用新的实验手段通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因也成为我们面临的一个课题本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。功能基因的克隆1.1图位克隆方法图位克隆又称定位克隆它是根据目标基因在染色体上确切位置寻找与其紧密连锁的分子标记筛选BCA克隆通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息从突变体开始逐步找到基因最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。1.2同源序列克隆目的基因首先根据已知的基因序列设计PCR引物在已知材料中扩增到该片段并经克隆测序验证利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针与待研究材料的cDNA文库杂交就可以获得该基因cDNA克隆利用克隆进一步筛选基因组文库挑选阳性克隆亚克隆并测序从中就可以筛选到该基因的完整序列。1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(LinkagedisequilibriumLD)。与连锁分析不同连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组只有相隔很近的基因才能仍处在相同的原始单倍型片段上基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种所以连锁不平衡程度很低林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域这就为目的基因的精细定位提供了可能结合SNP检测技术科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来进行数量性状寡核苷酸(QuantitativetraitnucleotideQTN)作图。当然除了相隔很近的基因某些相隔较远的基因由于受相同的选择压力也可能产生连锁不平衡。但通过家系分析首先可以进行目的基因的粗略定位将目的基因首先限定到一个较小的区域只针对该区域内的SNP进行相关性分析从而消除非由连锁引起的连锁不平衡干扰。随着林木全基因组测序的发展连锁图谱与LD分析相结合的方法将是在林木中实现未知基因克隆的最有效的方法[6]。1.4电子克隆近年来又兴起一种新的基因克隆方法--电子克隆它是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆新方法它的主要原理是利用日益发展的生物信息学技术借助电子计算机的巨大运算能力通过EST或基因组的序列组装和拼接利用RT-PCR的方法快速获得功能基因具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点[7]。1.4.1利用EST数据库信息首先选择感兴趣的水稻EST作为查询探针搜索水稻dbEST数据库找到部分重叠的EST进行拼接然后再以拼接好的EST重叠群为新的查询探针继续搜索dbEST库直到没有新的EST可供拼接为止最后根据拼接好的完整序列设计PCR引物通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证[7]。图1为利用EST数据库信息克隆水稻功能基因的试验流程。图1利用水稻EST数据库进行电子克隆的策略1.4.2利用基因组信息利用基因组信息资料进行电子克隆的最大优点就是基因的克隆不受作物发育时期或特殊环境条件的限制:可以用来源于任何时期或组织的水稻和其他物