啤酒酵母选育.docx

编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径学海无涯苦作舟页码：啤酒酵母选育项目紫外诱变及其突变株的性能测试1材料与方法1.1材料菌种：四铃啤酒酵母仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。培养基：麦芽汁培养基麦芽汁固体培养基。（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）1.2试验方法1.2.1酵母菌的活化取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养于28℃恒温培养箱培养14h得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液。然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上采用28℃恒温培养14h得到完全活化的正常生长的酵母菌。1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定1.2.2.1菌悬液的制备取1OmL菌液离心收集菌体洗涤2次后菌体悬浮于1OmL生理盐水中制得菌悬液。取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中摇匀130r/min振荡培养每隔2h取试管3个放入冰箱全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值以空白的麦芽汁培养液为对比根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。（此图视为参考）1.2.3紫外线诱变试验用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释使菌种的浓度达到lx106个／mL。(此处菌悬液浓度的确定采用三种方法：1.显微镜直接计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法)备注：平板直接计数法：如果过少菌液不易涂布开过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动不易形成单菌落且培养周期长耗时多工作量大但是也是我们的强项可以锻炼大一的动手能力。2：显微镜直接计数法：比较直观我们可以直接显微观察多人工作计数。耗时较短且工作量较小并且我系其他实验组采用此方法计数可供参考。3：光电比浊法：虽然绘制标准曲线要求较高但是工作量较小且一次绘制好标准曲线好后以后可以用准确率较高。比较三种方法我倾向于第一种和第三种二者相比较可以校正方案。实验步骤：打开30W紫外灯预热30min使其功率达到稳定。1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀28℃活化培养14h。2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min弃上清液加入4mL生理盐水洗涤在电磁振荡仪上震荡10min左右重复2次制成5mL悬液用血球计数板在显微镜下直接计数调整细胞浓度。3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板约为10-3、10-4、10-5每一个梯度3个平板每一个平板加0.2mL菌液进行培养后平板计数法作为对照。4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中加入一无菌磁力转子置于磁力搅拌器上。530W紫外灯下30cm处照射调整照射时间。本次预设为030456090120180600.（单位s）6取一定稀释梯度的紫外照射菌液0.1（视具体情况而定）用无菌涂布棒涂布均匀每组做三个平行线培养记录菌落数计算各照射时间下的致死率。（选在75%-80%）。致死率=未经照射菌落数-紫外照射菌落数未经紫外照射菌落数7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养然后重复1-5再重复第5步挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养连续进行5次28℃培养20h左右计算其突变率和致死率。（上述时间等数字视为参考数值）1.2.3.1初筛诱变后挑选在麦芽汁固体培养基上生长良好菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。1.2.3.2复筛供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。双乙酰含量测定：初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml120Bx麦芽汁发酵8d后测定发酵液中的双乙酰含量选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵将双乙酰含量明显降低的4株菌分别编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3和FB-E4。结果见表1表1发酵液中双乙酰含量的比较菌株FBFB-E1FB-E2FB-E3FB-E4双乙酰含量(mg/L)0.12330.07060.09260.07760.0870降低率(%)042.724.937.129.4（此处绘制表格样式视为参考）双乙酰代谢的控制：降低前驱物质α-乙酰乳酸的生产量措施：改良酵母菌种提高麦汁中α-氨基氮含量可以抑制合成酶的活性2加速双乙酰的还原措施：提高酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量）提高还原温度（封罐后高温还原）限制后期酵母的出芽率（封罐）国标中对于啤酒中双乙酰的量的要求二级啤酒：0.2mg/L一级啤酒：0.13mg/L方法：国标GB4927-2001检测培养条件：恒温12度发酵栓培养8d后检