大肠杆菌与遗传测序.pptx

主要通过检测什么检测大肠杆菌：
1、菌落数量
2、大肠杆菌生成物间接检测
(β-半乳糖苷酶,β-葡萄糖醛酸酶)
3、表面抗原
4、DNA

1、芯片化的大肠杆菌检测法由于CS（壳聚糖）带有大量正电荷因此常被用于絮凝吸附剂和不同作用的绑定试剂。因为在细菌和病毒细胞外膜表面具有羟基和磷酸根基团,常使其带负电荷,CS与细胞可通过静电作用可使其聚集。并且CS也常作为天然抗菌剂被大量使用。因此,CS的高吸附能力可使其用于细菌浓缩,并且作为扫集试剂可以保持细胞的活性。此外,通过将CS扫集、场放大样品堆积和反转电场富集技术联合使用,在微流控芯片上一体化实现了多步浓缩检测方法。（知道）
材料和仪器
三羟基甲基氨基甲烧(Tris),硼酸,乙二胺四乙酸(EDTA)购买于Aldrich公司(Milwaukee,WI,USA)。壳聚糖,牛璜酸和半胱氨酸购买于上海国药集团。大肠杆菌、E.coli)购买于广东微生物种质资源库。所有的实验在自制的微流控-激光诱导焚光检测系统(MCE)上实施。微流控系统主要由上海光谱有限公司提供。(了解)

细菌悬浮液的准备：大肠杆菌在LB培养基30度下培养13h。在3400rpm（每分钟转数）离心5min,上清液去除,再次用无菌水对细胞进行清洗,离心,重复这个过程5次以去除残留的培养基并且达到清洗细胞的目的。近红外核酸荧光染料SYTO62用来标记细菌细胞。最后,标记的细菌细胞悬浮在含有牛磺酸的缓冲溶液,浓度约1.0x107CFU/mL。在每次使用之前,新准备的细胞悬浮液需要漩祸60-90S以避免细胞聚集。（了解）微流控芯片系统的条件：用于实验的“十字”通道微流控芯片微通道深为25宽为100um。分离通道长为50mm,其他通道与交叉口的距离为10mm。铂电极作为电源与溶液之间的导电电极。芯片使用之前需要用98%的浓硫酸和去离子水各冲洗10min。随后,用1mol/LNaOH冲洗通道20min,再用去离子水冲洗10min,最后用运行缓冲溶液清洗10min。芯片清洗过后,将含有CS（壳聚糖）的分离缓冲芯片对通道进行预涂敷处理。（参考）微流控芯片多步浓缩方法用于细菌检测：对于场放大细菌堆积,与运行缓冲溶液相比,细菌细胞应该分散在更低电导率的样品缓冲溶液中。牛磺酸能够使细胞聚集从而改善检测灵敏度,将少量的牛磺酸添加到悬浮液中。下图是芯片电泳五步浓缩过程示意图。通过施加相应的电压对细菌细胞进行在线富集和浓缩。
（图）细菌在线富集分离机理示意图。(A)预上样;(B)进样,(C)场放大样品堆集和扫集,(D)反转电场富集,(E)分离。黑色区带代表浓缩的细菌样品,灰色代表样品基质,空白代表含有CS（壳聚糖）的运行缓冲,箭头表示电渗流方向。
AnalyticalChemistry,2012,84,1687，华东师范大学，王志芳标准条件下多步浓缩富集方法对大肠杆菌的定量检测曲线。自然水体中大肠杆菌的检测：由于地表水中细菌的浓度经常<30CFU/mL,具有较高富集倍数的检测方法才能测定河水中的大肠杆菌。此外,因为河水中常含有CO32-、SO42-等，运行缓冲的电导率远远低于河水。由于使用的浓缩方法部分是基于运行缓冲和样品缓冲中不同的电导率,因此必须过滤水样以去除水中含有的离子。此外,经过预富集的细菌水样的浓度必须达到多步浓缩方法的检出限。因此可以通过无菌滤膜过滤预富集水样中的大肠杆菌。多步浓缩富集方法对地表水中大肠杆菌的检测小结：为了提高检测灵敏度,能够实现实际样品中低浓度细菌的测定,将堆积、扫集和其它预浓缩方法的联合使用是必要的。我们通过使用微流控芯片展示了多步浓缩方法(CS扫描、反转电场和场放大样品堆积)可以用来加强细菌富集,实现低浓度污染的样品的测定。对比于常用的细菌检测方法,多步方法具有高灵敏度、低样品需耗量和快速分析的优点。（知道）1.2、纳升级液滴阵列实时定量RT-PCR系统的研究

综述：基于平面液滴阵列的微流控系统具有系统简单、成本低廉、液滴操控灵活、适于多步集成操作及液滴后续操作等优点,在微流控系统的实时定量PCR技术显示了广阔的应用前景,尤其是基于液滴的PCR系统。液滴微反应器将反应液分隔在单分散体系中,减少了PCR歧视及非特异性扩增;反应体积可为纳升至皮升级,与细胞体积相当,能够有效限制内容物的扩散,降低背景对信号的稀释作用;通过不溶相使液滴微反应器与微通道内壁间隔开来,最大限度地减少了通道内壁对试样的吸附,消除了交叉污染。（知道）背景：MicroRNA(miRNA)是一类非编码的小RNA序列,其长度只有18-25个碱基。越来越多的研究证明,miRNA在很多基因的表达过程中起到了分子开关的作用,在许多癌症及重大疾病的发生和发展中,miRNA都出现了异常表达现象。因此准确对miRNA进行定量检测具有重要的生物学和临床意义。（了