基因工程实验流程总览.ppt

基因工程实验流程总览DNA提取，纯化RNA提取构建基因组文库油菜TOC33基因片的克隆具体实验步骤Ⅰ.植物基因组DNA的制备Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
1)称取0.5g琼脂糖放入溶胶瓶中，再加入1ml50×TAE缓冲液，49ml高水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。
2)取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。
3)将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层均匀的胶面。
4)待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。
5)用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。
6)接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）；选择合适的电压，开始电泳；
7)当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1－2cm处，停止电泳。
8)将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有剧毒，戴手套操作）。电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条带，按1克胶：1000添加提取缓冲液，放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专用管中，6000转/分离心1分钟；
倒掉上清，再加入500微升的extractionbuffer,12000r/min离心1分钟；
倒掉上清，加入750微升的washbuffer,12000r/min离心1分钟；
倒掉上清，重复步骤三；
倒掉上清，在12000r/min下空转1分钟；
把带有膜的管子换到新的EP管中，加入30~50微升的水，静置1分钟，12000r/min离心一分钟，即得到所要回收的片断。此样品可用来做酶切等。IV.DNA片段的体外重组
加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。
将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右，取出酶切产物，用试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切片断以进行连接反应。IV.DNA片段的转化
1.从液氮中取出感受态细胞，完全融化后，用移液枪将连接产物加入感受态细胞中，温柔混匀，在冰上放置半个小时。
2.42OC热激90sec。再在冰上放10min，然后导入SOC（1.5mlEP管）中，在37OC摇床上200rpm进行振荡一小时。
3.在这段时间里可以准备平板，25ml左右加了抗生素的60度左右的LB固体培养基倒入事先灭菌的培养皿中，在表面涂布上X-gal和ITPG;
4.取出摇得菌液在离心机上6000转每分钟离心五分钟。然后将大部分培养基倒出，剩余大概五十微升左右的SOC即可。注意不可将沉淀倒出。
5.用移液枪将沉淀吹散均匀，将其加入事先倒好的平板上，加入涂布玻璃珠进行涂布。涂布均匀后将平板倒置放于37OC培养箱内过夜培养。第二天从转化的平板上挑去白色的菌落以验证是否是阳性克隆V.克隆的筛选与鉴定
1.用移液枪在1.5mlEP管中加入液体LB培养基500ul，再用灭过菌的牙签在生长蓝白斑的平板上挑取阳性克隆放于EP管中，丢弃牙签，盖紧管口，用报纸包好放到37OC，200r/min的摇床中过夜培养；
2.EP管出现混浊，用质粒提取试剂盒提取质粒。
3.对于得到的质粒再酶切电泳检测阳性克隆，如果酶切后的电泳图上出现了与插入片断相应大小的条带，证明是此单菌落是阳性克隆，否则是假阳性的。
试剂盒质粒回收过程VI.序列分析实验起始材料的选取和准备
mRNA的提取、纯化
目标片段的克隆和分析
DNA、RNA的提取、纯化和分析
克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析
基因转化实验及转基因结果分析
一、实验起始材料的选取和准备二、卵细胞mRNA的提取、纯化三、目标片段的克隆和分析1.通过SMART技术构建cDNA文库2.目标基因的克隆四、DNA、RNA的提取、纯化和分析质粒提取、分析水稻基因组DNA的提取、纯化和分析水稻各器官TotalRNA的提取、纯化和分析Southernblotting克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析克隆化基因的表达表达蛋白的纯化目标蛋白功能分析蛋白体内表达研究基因转化实验和转基因结果分析连接反应感受态菌的制备pMal-ade重组质粒的转化UNIQ-10柱式质粒小量抽提PCR筛选3．PCR反应循环条件设置
94℃变性反应1min；
55℃退火反应45s；
72℃延伸反应1min。
进行25个循环后，最后一个循环72℃延长至10min。迅速冷却4℃。

4、检测
加2μL溴酚蓝和10μL反应产物，混匀，取15μL反应产物点样电泳。

5、成像分析
在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳0.5~1h，电泳结束后EB染色15～20min，凝胶成像分析结果。pMD18-TVectorcDNA文库应用分离新基因的