基因分析的基本策略.ppt

从上世纪70年代以来，与DNA、RNA操作相关的各种分子生物学技术不断发展，到目前已经形成了一个庞大而复杂的技术体系。基因操作已成为医学研究的重要手段。简单地说，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技术。
本章主要讨论如何对基因进行定性、定量分析；在随后的2章里分别介绍基因功能研究的技术和基因工程的有关内容。1、需要进行基因的DNA序列分析:序列测定
2、基因的染色体上定位：原位杂交技术
3、研究基因在基因组中的拷贝数：SouthernBlot
4、研究基因表达水平：NorthernBlot、逆转录实时PCR技术
5、研究基因表达产物的水平：WesternBlot、流式细胞仪（FACS）第一节利用DNA定性、定量分析可从不同角度
对基因和基因组进行研究Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止。如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
基本步骤：
1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S），
2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、不完全的化学修饰；
3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断开DNA链；
4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开
5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况，直接读出DNA序列。
5`-GATCACTACTG-3`DNA自动测序仪1、揭示基因和基因组一级结构变化在医学研究中具有重要意义。
2、通过DNA序列分析，可以鉴定基因和基因组变异。
3、通过DNA序列分析，可以鉴定分析人工重组的基因。
4、通过DNA序列测定对定点突变进行确认。
分析基因拷贝数变化Southernblot步骤（4）Southern转膜：将凝胶中的DNA进行碱变性并将PH恢复中性后，即可将凝胶中DNA转移到固定支持物上。
固定支持物：硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等。
转移方法：毛吸管虹吸印迹法、电转印迹法、真空转移法。
（5）已知序列的DNA探针的制备
（6）Southern杂交：在将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能够结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合，在进行杂交实验前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。
（7）杂交结果的检测：采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和X线片装入暗盒，感光后，经冲洗，在X线片上可见黑色条带。1、对某种生物体基因组拷贝数研究，需要完整提取出基因组，并需要适当的限制性内切酶酶切；
2、通常要研究的基因序列是已知的。二、采用PCR技术也可以分析基因拷贝数PCR技术对扩增的模板浓度虽然很低，扩增产量以一个恒定的指数率上升，但经过25至30个循环，产量会达到一个平台期，同时PCR过程中，还会出现“试管效应”，因些对不同样本量的比较无法直接用PCR技术来鉴定。
近年来，随着PCR技术的不断改进，如差异显示PCR和实时PCR的发明，可以用于基因拷贝数的分析。是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。
根据PolyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。
将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。尽管应用差异显示PCR方法已经取得了不少成果，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个难以解决的问题：但它仍然存在几个难以解决的问题：(1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重复；(2)假阳性率可以高达90%；(3)获得的差异表达序列极少包含编码信息。（2）、代表性差异分析技术实时PCR根据