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第六章个别细胞和组织的培养第一节正常细胞培养一、上皮细胞类培养上皮细胞培养有三个难点: ①需求特殊底物,如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长; ②需求特殊培养基; ③与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长,并常压过上皮细胞。 纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。(一)表皮细胞培养 1.特点: 在有胶原的底物上易生长; 把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层(用射线照射后)上时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。 降低pH、Ca2+的含量和温度等,均利于表皮细胞生长。 向培养基中加氢化可的松(10μg/m1)、10-6M的异丙基肾上腺素(Isoproterenol)和10ng/m1促表皮生长因子(EGF)能促表皮细胞生长。【饲细胞】饲细胞(FeederCells)也称滋养细胞,是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。 饲细胞作用: 有同化营养液的能力。 饲细胞能促克隆细胞的生长,利于克隆的形成。克隆形成后饲细胞渐死亡,换液时清除。饲细胞的制备: (1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞,90%汇合时制成细胞悬液,再按103细胞/毫升重新接种培养; (2)在细胞半汇合时,准备0.25μg/ml的丝裂霉素,按2ug/105细胞的量加入到培养瓶中过夜;或用射线单次照射,剂量30~50戈瑞(Gy); (3)细胞经上述处理后,Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时,胰蛋白酶消化细胞制成悬液,按5×104/ml接种入新培养基中; (4)48小时后,即可用于细胞克隆之用。2.表皮细胞培养程序: (1)取材:取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成0.5~1cm2小块; (2)EDTA处理:先置入0.02%EDTA中室温置5分钟。 (3)冷消化:换入0.25%胰蛋白酶中,置4℃过夜; (4)分离:取出皮块,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开;(5)温消化:取出表皮单独处理;用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30~60分钟; (6)制细胞悬液:用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液; (7)加培养液:通过80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清. (8)培养:接种入碟皿中,CO2温箱培养。注意事项:冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散;如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散,此时亦可直接置入PBS中用吸管吹打制备细胞悬液;不再经过第二次消化。 (二)胃上皮细胞培养培养程序: (1)取材:取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许; (2)清洗:用含庆大霉素(400μg/m1)和两性霉素(2μg/m1的Hanks)液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成1mm大小; (3)消化:在I型胶原酶和透明质酸酶中,于37℃中消化80分钟; (4)离心:收集细胞悬液,800转/分离心后,Hanks液漂洗两次; (5)接种:末次离心后加入含有1%~2%胎牛血清的完全培养基,接种入不同孔数的培养板中;接种量依不同实验目的而定。 细胞接种后一般在16小时内贴壁,细胞呈多角形,成岛状或片状生长,以后逐渐联接成片。初代培养可维持2~3周,第一周末达高峰,最后逐渐衰退剥落。 (三)肝细胞培养2.初代消化法培养: (1)把肝组织切成2~4立方毫米的小块,用不合钙镁的BSS液洗两次; (2)移入1:1的0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(都用无钙镁BSS配制)中,4℃冷消化10~12小时后,通过250微米和64微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过亦可); (3)收集细胞、BSS液洗1~2次、计数、接种培养; 3.肝脏灌流法: 需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好。 (1)无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS洗除血污; (2)取5ml注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入胆管系统,并不时轻柔压肝脏,以便消化液进入肝小叶中; 消化液在肝内停留20~30分后,在吸出消化液的同时并轻柔压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出;(3)待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心分离,用RPMI1640培养基培养(较其它培养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。 (四)内皮细胞培养(1)取产后的新鲜脐带;如不立即培养可保存于4℃中,但不宜超过12小时;无菌剪取长10~15厘米一段。 其它如胚胎和幼体动物的大血管,亦可用于培养; (2)先用三通注射器吸温PBS液注入脐带的脐静脉中,洗除残血;注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流;(3)用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1%的胶原酶,待末端出现液体后结扎之,令充满血管,注入口亦应结扎,以防液体返流