生化制药基本技术生化制药技术.ppt

第三章生物制药的基本技术第二章生物制药基本技术基本制造方法生化制药的六个阶段一、原料选择和预处理（RawMaterialSelectingandPretreatment）3.生化及化学法：
A.自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在0-4℃，微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。
*由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少用。提取：也称抽提、萃取，就是利用一种溶剂对物质的不同溶解度，从化合物中分离出一种或几种组分的过程。分为固体处理（液—固萃取）和液体处理（液—液萃取）。
提取条件的选择：
1、溶剂:常用水、稀盐、稀酸、稀碱，有机溶剂如乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳、丁醇等。丁醇提取的pH、温度范围较广（pH3-6,-2-40℃）。适用于动植物和微生物原料。
2、pH:与溶解度和稳定性有很大关系，一般选择在pI的两侧。
四、分离纯化SeparationandPurification（4）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感的，要在低温下进行。
常在0-4℃范围内迅速操作。如尿激酶。
（5）盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后，经脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析，时间一般较长，应常换透析液，注意防止污染。
2、有机溶剂沉淀法
利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离目的蛋白质的方法。蛋白质的沉淀与溶解，与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数，使其溶解度变小，同时，还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。几种溶剂的介电常数
溶剂名称20℃时的介电常数溶剂名称20℃时的介电常数
乙醚4.33甲醇33
丙酮21.4水80
乙醇242.5mol/L甘氨酸水溶液137

经验：如30-40%乙醇沉淀的物质，改用丙酮时，其体积分数可减少10%左右。即可用
20-30%的丙酮；而70-80%乙醇沉淀的物质，可用50-60%的丙酮即可。

注：水有较高的介电常数，具有很好的溶剂性能，是一种广谱溶剂。有机溶剂法比盐析法分辨力强，沉淀也好过滤，易干燥，但对有些生物活性物质能引起失活和变性。应用时还要注意挥发和火灾等。有机沉淀法应注意的问题
5、离子交换层析
采用不溶性高分子化合物作为离子交换剂，分离纯化各种生化物质。
基本原理：离子交换树脂在水中能溶胀，溶胀后，其分子中的极性基团（活性基团），具有可扩散的离子，能与溶液中的离子起交换作用；非极性基团作为树脂的骨架，使树脂不溶于水并具有网状结构，为离子交换的进行及溶液和树脂的分离创造了条件。离子交换层析包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和力等物理化学过程。树脂种类和理化性能：
（1）强酸性阳离子交换树脂：功能团为磺酸基，pH一般没有限制。
（2）弱酸性阳离子交换树脂：功能团为羧基、酚基。在酸性溶液中不发生交换，pH愈大交换能力愈强。
（3）强碱性阴离子交换树脂：功能团为三甲基季胺基团。pH没有限制。
（4）弱酸性阴离子交换树脂：功能团为伯胺基、仲胺基、叔胺基。pH愈低交换能力愈大。影响交换速度的因素：
（1）树脂颗粒的大小：颗粒小，表面积大，能促进内部和外部扩散。
（2）搅拌和流速：加快搅拌速度或加大液体流速，都能减少树脂外液膜的厚度，从而使液相扩散速度增加。
（3）离子浓度：交换速度随离子浓度的上升而增加，达到一定浓度后交换速度不在升高。
（4）离子的水化半径：水化半径小的易被吸附。
（5）树脂酸碱性的强弱和溶液的pH：
（6）交联度大小：交联度愈小，树脂愈易膨胀，交换速度愈快。但交联度小的树脂选择性较差。
（7）有机溶剂的影响：当有有机溶剂存在时，会降低树脂对有机离子的选择性，而容易吸附无机离子。
6、凝胶层析
指化合物随流动相流经装有凝胶的固定相的层析柱时，因其各种物质分子大小不同而被分离的技术。又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。
优点：设备简单，操作方便，分离效果好，回收率高，分离条件缓和，不使活性物质失活变性，凝胶可重复使用，无需再生处理。缺点：分离速度慢。
广泛用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、酶及多糖等药物。
几种常用的凝胶：
（1）葡聚糖凝胶：基本骨架是1-6糖苷键。由葡聚糖和甘油以醚桥形式交联而成的网状结构。最著名的商品为Sephadex葡聚糖凝胶，珠状颗粒物，化学性质稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液。低温时，在0.1mol/L盐酸中保持1-2h不改变性质；室温时，在0.01mol/L盐酸中放置半年也不改变；在0.25mol/L的氢氧化钠中，60℃两个月没有发改变。可在120℃加热30min灭菌而不破坏，但高于120℃即变黄。湿状贮存易发霉，若