琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤.ppt

琼脂糖凝胶电泳Agarosegelelectrophoresis天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段缺点
1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。
2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。
3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。
4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。一、实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。三、实验材料、器具及药品
质粒DNA样品。
电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。
琼脂糖，1XTBE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液⑵用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。⑺将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。1、DNA分子的大小
双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；
2、琼脂糖浓度
浓度越低，相同核酸分子迁移越快；
3、DNA的构象
同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭
溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。
5、所用的电压
低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。
6、琼脂糖种类
常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围常用的电泳缓冲液TAE和TBE电泳缓冲液比较凝胶载样缓冲液6×凝胶载样缓冲液琼脂糖凝胶中DNA的检测使用EB染色注意事项凝胶中DNA的成像关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法\几点注意事项5）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降，这在酶切质粒与空白对照质粒一起电泳时应值得注意。
6）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分钟。
7）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2）比正极气泡（O2）多一倍。