病毒的纯化与保存培训课件.ppt

病毒纯化目的(了解)病毒纯化原理(熟悉)病毒纯化的一般原则(熟悉)细胞破碎方法(熟悉)病毒纯化方法聚乙二醇(PEG)浓缩法不同分子量PEG性质比较聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)超过滤法(熟悉)吸附法(熟悉)凝胶吸附法-磷酸钙凝胶凝胶吸附法-氢氧化锌凝胶凝胶吸附法-焦磷酸镁凝胶红细胞吸附法(熟悉)葡聚糖柱层析法(熟悉)葡聚糖柱层析法(熟悉)葡聚糖柱层析法葡聚糖柱层析法差速离心法(掌握)常用方法(熟悉)：以低速(2000-3000r/min)及中速(10000r/min)离心20-30分钟去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质，再选择较高速度离心1-2h使病毒沉淀。密度梯度离心10％～40％蔗糖密度梯度制备梯度混合仪等密度梯度离心(掌握)病毒蛋白的分离SDS-PAGEPAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳连续与不连续PAGE不连续PAGESDS-PAGESDS-PAGE浓缩胶首次应用SDS-PAGE的论文(了解)SDS-PAGE实验步骤(熟悉)1、清洗、烘干、组装电泳器材SDS-PAGE实验步骤2、1%琼脂封底SDS-PAGE实验步骤4、灌注分离胶SDS-PAGE实验步骤5、配制、灌注浓缩胶，插上梳子SDS-PAGE实验步骤5、往电泳槽加电泳缓冲液，上样电泳缓冲液(电极缓冲液)包含SDS
一般配制成10×或5×SDS-PAGE实验步骤7、电泳结束，剥胶，染色，脱色按下式计算相对迁移率：

每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分子量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。
符合如下方程式：LgMW=－bmR+K
其中，MW为蛋白质的分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数
因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量注意的问题WesternBlot蛋白质鉴定WesternBlot蛋白质鉴定WesternBlot步骤(熟悉)WesternBlot步骤WesternBlot步骤WesternBlot步骤WesternBlot步骤WesternBlot步骤病毒的保存(掌握)病毒的保存病毒的保存2、冷冻干燥保存步骤2、冷冻干燥保存步骤2、冷冻干燥保存步骤小结