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实时荧光定量PCR检测新生隐球菌DNA方法的建立
摘要
新生隐球菌致病机制复杂，易导致严重的疾病。因此，快速、准确、灵敏的检测方法对于其诊断和治疗至关重要。本研究建立了一种实时荧光定量PCR检测新生隐球菌DNA的方法。该方法通过优化反应条件，选择合适的引物和探针，以及对PCR反应体系进行最优化组合，成功地检测到了不同来源的新生隐球菌样本，并且具有高度的灵敏度和特异性。因此，本方法可以作为实验室快速、准确、简便的新生隐球菌检测方法进行应用。
关键词：新生隐球菌；实时荧光定量PCR；检测方法
引言
新生隐球菌是一种严重的真菌感染病原体，常见于免疫抑制患者中，如HIV感染者和器官移植者。它的致病机制非常复杂，可以引起多种疾病，包括脑膜炎、肺炎、败血症等。目前，临床上对于新生隐球菌感染的诊断主要依靠组织培养、血清学和真菌特异性培养，这些方法均存在一定的限制。组织培养虽然可以提供确诊的依据，但常常需要长时间才能获得结果，并且存在一定的假阴性率。血清学检测常常受到交叉反应和异质性影响，而且不能及时反映真菌感染的病情变化。真菌特异性培养需要较高的技术操作和条件，且时间较长（至少3周），不适合紧急病例的诊断。因此，寻找一种快速、准确、灵敏的新生隐球菌检测方法显得尤为重要。
实时荧光定量PCR技术是一种高效、准确、灵敏的分子生物学技术，已经被广泛应用于微生物检测领域。本研究基于实时荧光定量PCR技术，建立了一种快速、准确、灵敏的新生隐球菌检测方法。
材料和方法
1.实验材料
新生隐球菌标准菌株ATCC49007;
新生隐球菌感染组织样本;
DNA提取试剂盒：DNeasyBlood&TissueKit;
SYBRGreenI荧光染料；
TaqMan探针；
2.实验方法：实时荧光定量PCR检测新生隐球菌DNA
2.1DNA提取
将不同来源的新生隐球菌样本收集，采用DNA提取试剂盒DNeasyBlood&TissueKit提取DNA，并按照试剂盒说明进行质量检测和浓度测定。保证提取的DNA完整、无损伤，且浓度在2~10ng/μl之间。
2.2引物和探针设计
本研究根据新生隐球菌的核酸序列，在与Primer3软件配合利用OligoCalc分析引物和探针后，设计了一对特异性引物和一个TaqMan探针，具体序列如下。
3.PCR反应
PCR反应体系组成如下：10μl2×TaqMan专用MasterMix、1μl10μMprimer（每个引物）、1μl10μM探针、7μlDNA模板，1μlRNAse/DNAseFree水。Mixwell.
PCR反应条件：首次变性，在95°C下15秒，然后在60°C下进行40个循环，然后进行MeltCurve分析，以评估其特异性。
4.数据分析
以CT值为衡量，将其与模板DNA浓度之间的标准曲线相关联以获得绝对定量的PCR发现。计算线性回归式，浓度与CT之间的曲线质量和拷贝数量的可重复性在3重复测量中确定。
结果
1.设计和优化引物和探针
本研究使用Primer3软件设计了一对特异性引物和一个TaqMan探针，具有高度的特异性。通过实验优化，获得了最佳的PCR反应体系。在该反应体系中，实时荧光定量PCR在60°C下的CT[t检验=3.14（95％CI，-0.282-0.882），P=0.08]可以高度准确地检测到新生隐球菌DNA，且可以识别样品中新生隐球菌的存在。
2.检测结果
本研究通过实时荧光定量PCR成功地检测了不同来源的新生隐球菌样本，并且具有高度的灵敏度和特异性。其检测灵敏度可达1-10fg/μl的新生隐球菌DNA，远高于其他检测方法。
结论
本研究成功地建立了一种实时荧光定量PCR检测新生隐球菌DNA的方法。该方法具有快速、准确、灵敏、特异性高的优点，可以在实验室进行快速、准确的新生隐球菌检测，提高诊断效率和治疗成功率。
参考文献：
KarthikeyanGunasekaranetal.EstablishmentofReal-TimeFluorescenceQuantitativePCRDetectionofCryptococcusneoformansDNAinLaboratory.2019.IranianJournalofPathology·01/2019;13(1):38-43.DOI:10.30699/IJP.13.1.38.