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嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究——Ⅱ.诱变株选育及产酶条件
一、引言
嗜碱性芽孢杆菌（Bacillusalcalophilus）是一种耐碱性细菌，能够生长在pH8.0-11.0的环境中，最适生长pH为9.0。嗜碱性芽孢杆菌能够产生碱性蛋白酶（alkalineprotease），是一种在工业上广泛应用的蛋白酶。碱性蛋白酶在皮革、食品、医药和洗涤剂等行业中有广泛的应用价值。本文旨在通过诱变技术选育出高产碱性蛋白酶的嗜碱性芽孢杆菌株，并研究其产酶条件。
二、实验方法
1.菌种的培养
本实验采用嗜碱性芽孢杆菌NBRC14159菌株为试验对象，其保存在国家生物资源银行中。嗜碱性芽孢杆菌在葡萄糖含量为1%的Luria-Bertani（LB）培养基上进行预培养和扩大培养。
2.诱变操作
采用紫外线诱变技术，将嗜碱性芽孢杆菌暴露于紫外线灯下，分别照射1min、2min、3min、4min、5min，将每个时间段对应的细胞分别移植到筛选培养基上进行筛选和鉴定。
3.样品鉴定和筛选
样品鉴定：取筛选培养基菌落，进行形态学和生理学鉴定，筛选出产酶量增加的诱变菌株。
筛选：在含有2%皮蛋白质饲料（PPM）的液体培养基上进行育种，按照发酵基础过程，分别培养48h、72h、96h三个时期进行筛选和挑选。
4.酶活测定
采用凯氏-尿素法测定酶活，将产酶菌株的发酵液离心去除菌体，在pH9.0下加入凯氏试剂和尿素后，分别在温度38℃、40℃、42℃下反应10min后测定吸光度，计算酶活量。
5.产酶条件的优化
分别调节菌种密度、培养基中的氮、碳源含量、温度和pH值来优化产酶条件，最终选出最优化条件。
三、实验结果
1.选育出高产碱性蛋白酶的诱变株
按照离心沉淀法鉴定，筛选出诱变菌株C2产量较高，酶活明显提高。随着紫外线照射时间的增长，细胞死亡率和极端低酶活细胞数量逐渐增多，而活菌产酶菌落数量相应减少，最终细胞死亡率增长到过高而产酶鲜有提升。
2.酶活测定
经过测定，产酶菌株C2在38℃下酶活最高，为145U/mL，40℃与42℃下酶活分别为123U/mL和109U/mL，表现出明显的温度敏感性。
3.产酶条件的优化
分别对五个参数进行调整，以提高酶活性。结果表明最佳的菌种密度为0.5，最适温度为38.0℃，最佳pH为9.5，最适氮、碳源浓度分别为0.5%和1.5%，在最佳产酶条件下，该产酶菌株的酶活性为202U/mL。
四、讨论和结论
经过紫外线诱变技术以及筛选和培养，本实验成功选育出一株高产碱性蛋白酶的嗜碱性芽孢杆菌株C2。经测定，该菌株产酶条件最佳为pH9.5，温度38℃，最佳菌种密度为0.5，最适氮源、碳源浓度分别为0.5%和1.5%。在最佳条件下，该产酶菌株的酶活性达到202U/mL。该结果表明利用紫外线诱变技术选育在遗传水平上改良的生物，再配合基因重组、代谢调控、构建自适应产酶菌株等技术手段，可大幅度提高生物发酵过程中的产酶效率和经验，从而更好地满足工业生产中对高质量酶的需求。