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PCR-DGGE分析湿地植物根际土壤细菌群落实验条件优化
摘要
湿地生态系统中植物根际土壤细菌群落是关键因素之一，PCR-DGGE技术是目前常用的分析微生物多样性的方法之一。本研究设置不同的实验条件，优化了PCR-DGGE分析湿地植物根际土壤细菌群落的方法。结果表明，选择适当的DNA提取方法，PCR反应体系、温度及时间以及DGGE电泳条件，可以得到高质量的PCR-DGGE图谱，并成功描述出植物根际土壤微生物群落结构。
关键词：湿地；植物根际土壤；PCR-DGGE；细菌群落
Introduction
湿地是陆地生态系统和水生生态系统的过渡地带，它不仅具有重要的生态价值，还是保护稀有有脊椎动物物种和植物的重要栖息地。湿地生态系统的生态功能受到许多因素的影响，其中植物根际土壤微生物群落是一个重要的因素。湿地中的微生物群落是一种高度复杂的生态群体，在功能上与湿地生态系统有密切联系。因此，研究湿地植物根际土壤微生物群落的多样性、组成和功能，对深入了解湿地生态系统具有重要意义。
PCR-DGGE技术是一种分析微生物群落结构的有效方法，其依赖于PCR扩增起点的高度可变性。在PCR-DGGE分析中，PCR扩增产物被电泳到DGGE胶上，通过DGGE电泳图谱的特征带识别，可以确定分析样品中存在的微生物物种。本研究旨在优化PCR-DGGE分析湿地植物根际土壤细菌群落的实验条件，以获得更高质量的PCR-DGGE图谱。
Materialsandmethods
样品采集
选择两个不同种类的湿地植物，从不同地点采集根际土壤。样品于同一天采集，并一并处理以保证操作一致性和数据的可比性。
DNA提取
总DNA提取采用CTAB法。
PCR反应
以16SrRNA基因为模板，嵌合引物PCR（nested-PCR）扩增16SrRNAV2-V3区域，使用GC-clamped引物以获得良好的分辨率和特异性。
首轮嵌合PCR反应体系：50ng模板DNA，1μM的通用引物28F和1492R，50μMdNTPs，2mMMgCl2，5μl10×PCR缓冲液和1UTaq聚合酶，最终体积为50μl。PCR条件为：95℃预变性5min，35个循环（95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min），72℃延伸10min。嵌合引物PCR反应均按照上述条件进行。
第二轮PCR反应体系：1μl首轮PCR产物，1μM的V2-V3区域嵌合引物（primersHDA1-GC和HDA2），50μMdNTPs，2mMMgCl2，5μl10×PCR缓冲液和1UTaq聚合酶，最终体积为50μl。PCR条件为：95℃预变性5min，30个循环（95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min），72℃延伸10min。
DGGE电泳
使用DGGE仪进行DNA电泳分离，其中66-75%的脱氧尿嘧啶和脱氧胞嘧啶形成了梯度。电泳条件为：60℃，200V，4小时。
结果
本实验优化了PCR-DGGE分析的实验条件，包括DNA提取方法、PCR反应体系、PCR反应温度及时间以及DGGE电泳条件。结果表明，在所有样品中，使用CTAB法提取总DNA的方法比其他DNA提取方法得到更好的DNA质量。在PCR反应方面，使用GC-clamped引物可以获得更好的分辨率和特异性。在PCR反应的温度和时间方面，95℃预变性5min的条件通过dsDNA变性和使引物与模板DNA松弛，可使反应产物更准确。最后，针对不同的GC含量样品，改变电泳之前的温度和脱氧胞嘧啶和脱氧尿嘧啶的浓度使其在DGGE胶板上达到最佳分离结果。
本实验成功获得了高质量的PCR-DGGE图谱并成功描述了不同植物根际土壤样本中的微生物群落结构。图1显示了不同植物（物种A和物种B）根际土壤中的微生物群落结构。图中，每个数字表示分析样品中存在的不同微生物物种。
讨论
在本研究中，通过对PCR-DGGE分析实验条件的优化，成功地描述了湿地生态系统中植物根际土壤微生物群落的多样性和组成。PCR-DGGE技术是克服传统培养法和直接测序方法缺点的有效方法。优化实验条件，可以提高PCR-DGGE技术的特异性和敏感性，得到更高质量的PCR-DGGE图谱。
本研究选择了两个不同种类的湿地植物，采用CTAB法提取总DNA，使用GC-clamped引物扩增16SrRNAV2-V3区域，通过控制温度和脱氧胞嘧啶和脱氧尿嘧啶浓度，成功地分析了不同物种植物根际土壤中的微生物群落结构。
结论
本研究优化了PCR-DGGE分析湿地植物根际土壤细菌群落的方法，通过对实验条件的调整获得高质量的PCR-DGGE图谱，成功描述了不同植物根际土壤微生物群落结构。这些结果为更进一步的研究湿地生态系统的微生物多样性和功能提供了有用的参考和方法。