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丝状真菌原生质体技术研究(Ⅵ)——高脚小伞原生质体的制备与再生
丝状真菌是一类广泛存在于自然界中的生物，其菌丝是由多个细胞体组成并通过壁的连接形成的。在真菌研究中，原生质体技术是一项重要的研究方法。本文将围绕“丝状真菌原生质体技术研究(Ⅵ)——高脚小伞原生质体的制备与再生”这一主题展开讨论，旨在提供一些理论依据和实验指导，以期对相关领域的研究者有所帮助。
一、高脚小伞概述
高脚小伞（scientificname：Morchellaesculenta）是一种食用菌类，也是一种具有经济价值的真菌。高脚小伞主要生长在湿地和山区等环境中，其形态独特，外观酷似一个小型的蕈类，极为美味，因此深受人们的喜爱。除了食用价值，高脚小伞对环境的改善也有很大的作用，其菌丝可以分解有机物质，达到净化环境的目的。
二、原生质体技术
原生质体是细胞质在细胞壁破坏后形成的自由状态，原生质体技术利用该状态下的质体进行实验研究。原生质体技术已经广泛地应用于细胞生物学、遗传学、分子生物学等各种领域中。在丝状真菌研究中，原生质体技术也是一项重要的工具。
原生质体制备的关键是选择合适的酶解剂和酵素活性。常用的酵素有纤维素酶、果胶酶、黑曲霉素等。在进行丝状真菌原生质体制备时，应选用合适的酵素进行酵解处理，达到最优化的效果。
三、高脚小伞原生质体制备方法
1.材料准备
高脚小伞为实验材料，生长在30℃下的木质根茎上。其他实验材料包括70%乙醇、EDTA、Tris-HCl缓冲液、SDS等。
2.酶解处理
将高脚小伞菌丝均匀切成约0.5cm长的片段，用70%乙醇浸泡15分钟，再用5%EDTA溶液浸泡30分钟，去除表皮。将菌丝放入含有0.4%纤维素酶和0.2%黑曲霉素的0.6mol/LSorbitol液中，转轰摇培养箱中，温度为25℃，250rpm转速，4小时。
3.原生质体分离和筛选
将酶解后的高脚小伞菌丝转移到100mm×15mm的离心管中，离心1800g，4℃，15分钟。去除上清液，用相同的离心液洗菌丝三次，每次离心后取上清液至不同的离心管中。在离心过程中，按照上清液的层数，将原生质体从上到下依次取至不同的离心管中。
4.原生质体的筛选
对分离出的原生质体根据显微镜下的形态特征和大小进行筛选，选取尺寸适中，形态规整的原生质体进行下一步的实验研究。
四、高脚小伞原生质体的再生处理
将分离筛选出的原生质体经过1h不吸气自然沉淀，在浓度为0.5mol/L的CaCl2溶液中进行渗透处理，处理时间为60min，温度为14℃。渗透处理后，将原生质体移入含有400mMmannitol和10mMCaCl2的LMP培养液中进行再生处理。细胞再生液混合培养，将培养温度控制在温度为25℃，250rpm转速，培养时长为2d。
五、结论
本文介绍了高脚小伞原生质体的制备方法，该方法采用纤维素酶和黑曲霉素等酵素进行酵解处理，经过分离和筛选，制备出形态规整、尺寸适中的原生质体，再经过渗透处理和再生处理，获得了具有再生能力的高脚小伞原生质体。这一方法可为丝状真菌研究提供一种新的实验手段和基础数据支持。