高效液相色谱分析.docx

第3章高效液相色谱分析
教学时数：2学时
教学要求：
1、了解高效液相色谱法的基本原理及使用范围。
2、理解常用检测器的原理、优缺点及适用范围。
3、理解各种分离方式（液固色谱；液液色谱；键合相色谱；离子交换色谱；离子对色谱；排阻色谱）的原理、适用的分析对象及选择原则。
教学重点与难点：
1、高效液相色谱与气相色谱的异同点。
2、高效液相色谱仪的组成及工作原理。
3、高效液相色谱的分离方式。

3.1概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末发展起来的一种新型分离分析技术，已成为化学、生物化学与分子生物学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术。
它在技术上采用了高压泵、高效（化学键合）固定相和高灵敏度检测器，具备高压、高速、高效的特点。
一、液相色谱的特点：

二、
与气相色谱法比较，HPLC的优点：
1、分析对象广气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。
2、流动相对分离起作用气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。
3、经常在室温条件下操作气相色谱法一般在较高温度下进行
三、固定相与流动相
液相色谱固定相液相色谱流动相
1样品有合适的极性和良好的选择性
2与检测器匹配
3高纯度
4化学稳定性好
5低粘度（粘度适中）
1传质快
2寿命长
3耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定
4选择性好
5有利于梯度洗脱

四、高效液相色谱仪
高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。

图高效液相色谱仪的流程
一、高压输液泵
高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。
基本要求：⑴流量准确可调，0.1～10ml/min
⑵耐高压，40～50MPa
⑶液流稳定，无脉动
⑷死体积小，要求小于0.5ml
二、梯度洗脱装置
梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。
内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。
外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
三、进样装置
通常使用耐高压的六通阀进样装置。
四、色谱柱
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
柱子内径一般为1～6mm。常用的标准柱型是内径为4.6或3.9mm，长度为15～30cm的直形不锈钢柱。填料颗粒度5～10μm，柱效以理论塔板数计大约7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
五、检测器
1、紫外吸收检测器
紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。它灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱，它要求被检测样品组分有紫外吸收，使用的洗脱液无紫外吸收或紫外吸收波长与被测组分紫外吸收波长不同，在被测组分紫外吸收波长处没有吸收。
2、光电二极管阵列检测器（PDAD）
3.、示差折光检测器（DRD）
示差折光检测器也称折光指数（RI）检测器，是一种通用型检测器，只要被测组分与洗脱液的折光指数有差别就可使用。
4、电导检测器
是离子色谱法应用最多的检测器，依据物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质的含量。受温度的影响较大，需放在恒温箱中。pH>7时不够灵敏。
5、荧光检测器
荧光检测器是一种专用型检测器，灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高，在HPLC中应用较多。仅次于紫外吸收。它用于能激发荧光的化合物。
6、蒸发激光散射检测器
3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
一、理论基础
热力学理论：塔板理论——平衡理论
动力学理论：速率理论——Vander方程
在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：
H=A+Cu

液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，
高效液相色谱中，主要的影响因素是传质阻力。
措施：减小固定相填料颗粒直径、降低流动相粘度
二、液相色谱分离的条件：
1选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）
2选粘度