荧光定量PCR技术.docx

常规PCR中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等，如此，荧光定量PCR技术便应运而生。1、荧光定量PCR概念所谓定量PCR技术（real-timePCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（如下图）。

2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（如下图），所以在实验过程中我们不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。

而从上图我们也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线都有一个共同的拐点，而且拐点极具重现性，为荧光定量PCR技术的应用提供了理论基础。3、几个基本概念为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR技术，接下来有必要向大家介绍几个最基本的概念。3.1扩增曲线为了更好的理解荧光定量PCR原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。前面我们也了解到，PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线(如下图)

从上图我们可以很直观的看出，荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。3．2荧光阈值
我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（机器自动设置）。我们在做荧光定量PCR实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（如下图）。

3．3Ct值了解了荧光阈值的概念后，Ct值就很好理解了。C代表Cycle，t代表threshold，所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

如上图所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为Ct值。因为Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。前面也提到过，同一模板经过96次PCR扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct值做出标准曲线，只要在同一次PCR实验中得到未知样品的Ct值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。3．4标准曲线在绝对定量实验过程中，我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释，将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR实验中进行反应，将稀释标准品得到的Ct值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量（如下图）。荧光定量PCR标准曲线示意图

理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距（上图左），如果PCR反应呈理想的方式扩增，产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距则符合等式“2n＝稀释倍数”，n为2样本间Ct值差。例如：10倍稀释的样本，2n＝10，可得n＝3.32，Ct值差3.32。3．5扩增效率扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指