枯草芽孢杆菌.docx

芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。常用培养基配方：1L蒸馏水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+15-20g琼脂能耐氧化；耐挤压；耐在快速繁殖过程中，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachitegreen）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。
将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6％）染10分钟。（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。】
在pH为5.5~8.5时生长良好，最适生长温度为370
一、目的要求1、学习分离、纯化噬菌体的基本原理和方法。2、学习噬菌体效价测定的基本方法。二、基本原理因为噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现奇特异的噬菌体的存在，亦即噬菌体是伴随着宿主细菌的分布而分布的，例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，故也能很容易的分离到大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。由于噬菌体侵入细菌细胞后进行复制而导致细胞裂解，噬菌体即从中释放出来，所以，（a）在液体培养基内可使混浊菌悬液变为澄清，此现象可指示有噬菌体存在；也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的噬菌体；（b）在宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌而形成透明的空斑，称噬菌体斑（图1），一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体的效价。本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚分离出的噬菌体常不纯，如表现噬菌斑的形态、大小不一致等，然后再进一步纯化。噬菌体的效价就是1毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌体斑，因此，能进行噬菌体的计数。二、器材37℃培养18小时的大肠杆菌斜面，阴沟污水；本实验均用普通肉膏蛋白胨培养基500毫升三角瓶内装三倍浓缩的液体培养基100毫升，试管液体培养基，琼脂平板，上层琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，没管4毫升），底层琼脂平板（含培养基10毫升，琼脂2%）大肠杆菌18小时培养液，大肠杆菌噬菌体10-2稀释液（用肉膏蛋白胨液体培养基稀释）含0.9毫升液体培养基的小试管4支，肉膏蛋白胨琼脂平板（10毫升培养基，2％琼脂，作底层平板用），含4毫升琼脂培养基的试管（0.7％琼脂，作上层培养基用）5管，灭菌小试管5支，灭菌1毫升吸管10支，48℃水浴箱等。灭菌吸管，灭菌玻璃途布器，灭菌蔡氏细菌滤器，灭菌抽滤器，恒温水浴箱，真空泵等。
1、噬菌体的分离（1）制备菌悬液取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。（2）增殖培养于100ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200ml与大肠杆菌悬液2ml，37℃培养12～24小时。（3）制备裂解液将以上混合培养液2500r/min离心15分钟。将以灭菌的蔡氏过滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，用橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶，安全瓶再连接于真空泵（如图2）。图上的真空表接或不接均可。将离心上清夜倒入滤器，开动