实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定.docx

本科学生实验报告

学号：124120463姓名：
学院：生命科学学院专业、班级：12级生物技术班
实验课程名称：酶工程实验一
教师：吴倩
云南师范大学教务处编印

实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定
一、目的要求
1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。
2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。
二、基本原理
（一）淀粉酶产生菌的分离
1.菌种的采集
①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。
②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。
2.富集培养
①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。
②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。
3.菌种的分离
①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。
②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。

（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制
1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
2.酶活定义：在一定pH5.5、37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。
酶活计算公式：酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W）
A:样品的OD值(平均值)K:标准曲线的斜率
N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积
T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000μmol
W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）

3绘制标准曲线
①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
②以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。
③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量

三、器材
1试剂:
可溶性淀粉、碘、碘化钾、HCl、柠檬酸、Na2HPO4·12H2O等
2培养基:
分离、纯化培养基
3仪器:
①平皿、三角瓶、大试管、1mL和10mL移液枪、涂棒；
②天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。
四、操作步骤
（一）淀粉酶产生菌的分离
1.培养基的配制及灭菌
倒平板配制分离培养基高压灭菌30min冷却至约50℃
倒7块平板/140mL冷却备用
2.制备土壤稀释液
①称取土样1g，放入9mL无菌水试管中，摇动10min，静置10min,制备得到10-1土壤稀释液；
②用无菌吸管吸出1mL土壤悬液，加入盛有9mL无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到10-2土壤稀释液；
③再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3土壤稀释液；
④以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。
3.涂布
用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6和10-7土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。
4.培养纯化
挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养2～3d(如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养)。
5.产淀粉酶微生物的鉴定
向平板内加入稀碘液数滴后进行观察
（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制
1.淀粉酶产生菌的发酵
①分离培养基（140mL）的配制：
可溶性淀粉：0.7g蛋白胨：0.7g酵母膏：0.7g
KH2PO4:0.07gMgSO4•7H2O:0.02gCaCl2•2H2O:0.08g
琼脂:2.8g
②配置发酵培养基200mL/组（40mL/瓶）将纯培养得到的（透明圈最大的）菌落接种于发酵培养基中30℃150r/min摇瓶发酵约72h。
2.葡萄糖标准曲线的制作
①精确称取0.100g葡萄糖，用缓冲溶液定容至100ml，制得浓度为1mg/ml的葡萄糖的标准溶液。标准曲线如下图表所示：
葡萄糖标准溶液
体积（ml）0.00.20.40.60.81.01.2葡萄糖含量（mg）0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS(ml)3333333定容总体积(ml)1