dna蛋白质的相互作用.pptx

dna蛋白质的相互作用引言凝胶阻滞试验
DNaseI足迹试验
甲基化干扰试验
体内足迹试验
酵母单杂交技术
染色质免疫沉淀技术
噬菌体展示技术
核酸适体技术
生物信息学方法
蛋白质芯片技术及纳米技术一、凝胶阻滞试验（DNA迁移率变动试验DNAmobilityshiftassay）2主要步骤及内容：
制备探针DNA（P32放射性同位素标识DNA）
同细胞蛋白质提取物一道温育，形成DNA-蛋白质复合物。
将它加样到非变性聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳分离。
应用放射自显影技术显现具放射性标识DNA条带位置凝胶阻滞试验不但能够用来判定在特殊类型细胞提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合蛋白质分子(比如特异转录因子等)，而且还能够用来研究发生此种结合作用之准确DNA序列特异性dna蛋白质的相互作用材料及试剂：
2X结合缓冲液：
20mMTrispH7.5、100mMNaCl、2mMEDTA、10%甘油、
poly(dI-dC)(5mg/mlinTE)、BSA(10mg/ml)、
P32-标识探针
缓冲液C：
20mMHEPESpH7.9、25%glycerol、420mMNaCl、1.5mMMgCl2、
0.5mM二硫苏糖醇、0.5mM苯甲基磺酰氟化物、0.2mMEDTA
4%天然聚丙烯酰胺凝胶(50ml)：5ml40%丙烯酰胺(30:1)、2.5ml5X四溴乙烷，
41.95mlH20、0.5ml10%APS（过硫酸铵）、50ml四甲基乙二胺、0.25X四溴
烷电泳缓冲夜。
填充染料：
0.2%溴酚蓝、0.2%二甲本蓝、50%甘油
操作步骤：
1.配置反应混合液：探针DNA(1ng/ml)0.1ml、
dH206.3ml、2x结合缓冲液12.5ml、BSA(10mg/ml)1.0ml、
poly(dI-dC)(5mg/ml)0.1ml、
2.在细胞提取物中加入缓冲液C至5ml。
3.加10~15mg上述溶液（£5ml)到反应混合物中，总体积应小于25ml。
4.在室温下培养20min。
5.加入2.5ml填充染料。
6.装载样品到4%聚丙烯酰胺凝胶柱中。
7.室温下跑电泳2.5h，至溴酚蓝距底部1cm处停顿。
8.80℃下干燥凝胶，进行放射自显影处理。二、DNaseI足迹试验(DNaseIfootprintingassay)假如在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区
准确序列。
三、甲基化干扰试验检测靶DNA中特异G残基优先甲基化对而后蛋白质结合作用会有什么效应，从而愈加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用模式。
DMS化学干扰只能在G和A残基甲基化，不能使T和C甲基化。
故本试验为足迹试验补充伎俩。四、酵母单杂交技术设计含目标基因(称为诱饵)和下游汇报基因质粒并将其转入酵母中;
将文库蛋白编码基因片段与GAL4转录激活域融合表示cDNA文库质粒转化入同一酵母中;
若文库蛋白与目标基因相互作用可经过汇报基因表示将文库蛋白编码基因筛选出来.注：这里作为诱饵目标基因就是开启子DNA片段，文库基因所编码蛋白就是开启子基因结合蛋白.酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作用研究。不足以充分反应生理条件下，DNA与蛋白质相互作用真实情况。
因为，高等生物基因组有染色质结构，
用以上所提到方法分析得到某段DNA与蛋白质，在生理状态下，
这段DNA很可能并不与其相对应因子相结合。
另外，染色质结构本身是动态，DNA与非组蛋白在生理状态下相互作用通常是瞬时，
以上方法难以捕捉到发生在染色质上基因表示调控瞬时事件八、染色体免疫沉淀技术Chromatinimmunoprecipitation（ChIp）2、主要步骤及内容1.细胞甲醛固定

在1%甲醛作用下，DNA碱基上氨基或亚氨基和蛋白质上氨基包含赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸侧链氨基与另外DNA和蛋白质上氨基或亚氨基交联在一起，在几分钟内形成生物复合体，预防细胞内组分重新分布。
加入甘氨酸来终止交联反应。
2.超声波断裂染色质

甲醛交联后染色质对限制酶和DnaseI高度抵抗，
所以通常使用超声波使得染色质断裂。
打断后染色质片段平均长度应该在500-1000bp左右。
（能够用琼脂糖凝胶电泳来判定）3.氯化铯等密度离心纯化交联染色质

氯化铯等密度离心能够除去未交联蛋白质、
DNA和RNA样品中加入0.5%十二烷基肌氨酸钠，
通常在4000rpm离心72h。
离心后，用连接到蠕动泵0.25mm毛细管从梯度底个别步搜集染色质组分，在4℃透析过夜。4.染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体纯化

用目标蛋白特异性抗体进行染色质免疫沉淀。
抗体量要进行优化预防非特异结合。
用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀复合体。
经过洗涤除去非特异结合染色质后，
用1%SDS