联合测定法.docx

酶—蛋白联合测定法

包括：
(1)可溶性蛋白(solubleprotein)，
(2)超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)，SOD
(3)过氧化物酶(peroxidase)，POD
(4)丙二醛(malondialdehyde)，MDA
(5)过氧化氢酶(catalase)，CAT
2 联合测定的原因：
节省人力，节省提取研磨过程
节省待测样品
3 联合测定的可行性：
（1）汪俏梅，郭得平（2004）对POD、SOD、CAT进行联合测定。取1g西兰花样品，按1:5(W/V)加入0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆于4℃，13000g离心20min，上清液为酶提取液，分别测定POD、SOD、CAT活性。
（2）叶陈亮，柯玉琴，陈伟（1996），对可溶性蛋白、MDA、SOD、LOX进行联合测定。称1g花蕾，用含1%聚乙烯吡咯烷酮的50mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液4ml与冰浴中研磨匀浆，15000r/m冷冻离心10min，上清液备用。
取上清液50μl，按Folin-酚法测定可溶性蛋白质含量；
取上清液1.25ml，加水1.25ml和0.5%硫代巴比妥酸三氯醋酸溶液2.5ml混匀，煮沸10min后离心比色测定，按陈贵推荐公式计算MDA含量；
取上清液10μl，按朱广廉法测定SOD活性，以SOD抑制NBT光化学还原50%所需酶量为一个酶活性单位；
取上清液0.5ml，按Surrey法比色测定LOX活性，以每分钟增加1个OD值为一个酶活单位。
4 联合测定的缺点
（1）时间比较紧张，要求合理安排顺序，相互之间溶液干扰；
（2）最好是同时做，人员比较多；
（3）仪器，尤其是分光光度计要求要足够，不要相互之间抢；
（4）需要标准曲线的最好一起做，它要求所有待测样尽量在同一条件下测定。其它酶也是么？解决，减少实验次数，集中在1-2次内完成。做大量的预备实验，熟练技能。达到实验组每个成员倒背如流。
方案
想最后都一起测，理由是我们认为可以保证较低温度和酶活性不失活，并且我们保证人员充足，速度达到或接近单个指标的测定。如果大批量同时测的话，分光光度计最多可以得到3台/4台。

复合物的提取（主要是酶）
（一）冰浴研磨法
取样，1.0g样品
放入事先预冷的研钵，先加入2ml的提取液（先预冷），加入少量石英砂，冰浴研磨至匀浆
再加入3ml提取液继续研磨
转移至10ml离心管，用2ml提取液冲洗研钵，混匀
冰浴抽提30min，不时的轻摇
离心，4℃，13000g，15min
将上清转移至带刻度的试管，记录每一试管的体积
将酶液保存在冰浴中，严格保护，备用
注（1）提取液总体积为7ml，即选用7倍体积的提取液
（2）提取缓冲液成分：
50mM磷酸缓冲液pH7.5
内含（1）PVP1%
（2）EDTA2mM，pH8.0
（3）β-巯基乙醇0.04%
（二）液氮研磨法
取样，1.0g西兰花花蕾样品
放入事先预冷的研钵，加入液氮，并加入少量石英砂，研磨至粉末，用预冷的药匙将粉末转移至10ml离心管，加入7ml提取液，冰浴保护30min，不时摇匀
离心，3900rpm，20min，尽量保持在低温
将上清液转移至10ml量筒，记录体积，转移至10ml离心管，低温保护备用

第一部分可溶性蛋白含量的测定
——考马斯亮蓝（G-250）法
原理
考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大吸收在488nm，当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其吸光值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间达到平衡，完成反应非常迅速；其结合物在室温下1小时内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便、快捷，反应非常灵敏。灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级的蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/ml，是一种非常常用的微量蛋白快速测定方法。

试剂配制
1 牛血清白蛋白标准溶液的配制：
准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，即为1000μg/ml的原液（4℃保存）。
蛋白染色剂—考马斯亮蓝G-250的配制：
称取100mgG-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（w/v）的磷酸，最后定容至1000ml。此溶液在常温下可保存1个月。
注意：
（1）乙醇可用无水乙醇配，无水乙醇与95%乙醇价格差0.5元左右；
（2）磷酸本身浓度为85%。
标准曲线的制作
1 标准曲线的制作
（1）0~100μg/ml标准曲线的制作
取6支10ml干净的具塞带刻度的试管