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灵芝漆酶基因的克隆
摘要：综合运用苯胺蓝平板脱色法和愈创木酚法对实验室各菌种是否会产木质素降解酶进行简单定性分析。而后，运用基因组步行技术去克隆到一个全新的灵芝漆酶结构基因和其对应的全长cDNA,并对其序列进行分析。
关键词：定性分析，基因组步行，漆酶结构基因

漆酶（英文名称:LaccaseCAS编号：80498-15-3）是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。
漆酶其独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用,作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段。漆酶构成的生物检测器主要有两种:漆酶电极和漆酶酶标。
本文利用漆酶Cu离子结合区氨基酸序列高度保守特点，设计简并引物，综合运用基因组步行等分子生物学技术从灵芝中克隆到一个全新的漆酶基因。
1.实验材料
1.1酶和试剂
①限制性内切酶、限制性内切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、Ex．TaqDNA聚合酶。
②4种dNTP和OneStepRT．PCRKit，TRIzol试剂，OligotexmRNAMiniKit，DNA纯化试盒。
③愈创木酚、苯胺蓝。
2.1.2菌株
①毛绒鬼伞0901
②大肠杆菌XL10-Gold
③载体pMD18-T
2.1.3主要仪器
①UV754紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；
②YXQ-LS-SH全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；
③QYC211摇床：上海福玛实验设备有限公司；
④AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；
⑤SHP-150型生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；
⑥DZF-6050真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；
⑦HH-S28s数显恒温水浴箱：上海精宏实验设备有限公司；
⑧超低温冰箱：上海精密科学仪器有限公司；
⑨台式高速离心机：上海化工机械厂；
⑨LG2020电泳成像系统：河南兄弟仪器设备有限公司；
⑩全自动PCR仪：上海山富科学仪器有限公司。
2.2实验方法
2.2.1试剂配制
以下试剂配制均参考《现代分子生物学实验技术》(第二版)
PDA苯胺蓝培养基：含苯胺蓝0.1g/L，琼脂20g/L。
PDA愈创木酚培养基：含愈创木酚0.04%，琼脂20g/L。
DEPC水：吸出1mL放在1000mL双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000mL容量瓶中静置24小时用于处理仪器，高压灭菌用于配置试剂。
75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)
1MTris-Cl：121.14gTris-base溶于800mL水中，用冰乙酸调PH值至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌。
0.5MEDTA：EDTA186.1g溶于800mL水中，用NaOH调PH值至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌。
10mg·mL-1溴化乙锭：在10mL水中加入100mg溴化乙锭，溶解后分装成1mL小份，4℃保存。
5XTBE：Tris-base54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA(pH8.0)20mL，加水至1000mL。
凝胶加样缓冲液：溴酚蓝0.4%，蔗糖60%。
2.2.2木质素降解酶的简单定性
PDA苯胺蓝平板退色试验[1]将试验菌接种于PDA苯胺蓝培养基平板，28℃下避光培养，记录蓝色培养基中有无退色现象的产生，有则记为+，反之记为-。+表示该菌株能产LiP和MnP。
PDA愈创木酚平板显色试验[2]将试验菌接种于PDA愈创木酚培养基平板上后，置28℃下培养，每天记录有无红棕色变色圈的产生，有红棕色圈者记为+反之记为-。+表示该菌株能产Lac。
2.2.3毛绒鬼伞（0901）菌丝体的培养、诱导及预处理
用接种环挑一环试管种接入盛有25mlPDA液体培养基的250ml三角瓶，置恒温摇床中，28℃，240r／min振荡培养约4d，菌丝体足量后加入250ul100mmol／L的2，5-二甲苯胺诱导漆酶基因的表达，24h内收集菌体，用DEPC处理的dHO配制的PBS缓冲液清洗3次，滤干后迅速置于液氮中冻存10min，备抽总RNA和总DNA[3]．
总DNA、总RNA的抽提和mRNA的纯化
分别参见TRIzol试剂和OligotexmRNAMiniKit操作手册[4]．
2.2.5基因组步行
具体操作步骤详见Clontech公司UniversalGenomeWalkerTKitUserManua1
2.2.6SMARTTMRACE[5]
SMARTTM3'-RACE的原理
利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有S