抗菌肽体外抑菌实验方法.docx

微量肉汤稀释法（borthmicrodilutionmethod）
实验方法：
用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1280g/L的储备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸（含0.4%BSA）稀释，在用0.01%乙酸（含0.2%BSA）溶液对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为640，320，160……1.25mg/L的共10个梯度的系列稀释液，4˚C下保存备用。
将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管中的MH肉汤，37˚C，180r/min过夜培养。将培养后的菌液稀释至2*10^5-7*10^5CFU/mL，向无菌的96孔平板中的1-11孔各加入100µL的菌液，12孔不加入菌液而加入100µLMH肉汤，然后从1～10孔逐一加入相应的待测抗菌肽，11孔作为扫描对照组不加肽。37˚C，90r/min培养18-24h，这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64，32，16，……0.125mg/L。（不知道待测抗菌肽添加量是多少，最终抗菌肽的终浓度怎么缩小了10倍）
最小抑菌浓度MIC（mininmalinhibitoryconcentration）就是能阻止50%以上细菌生长的最小肽浓度。用酶标仪在490nm下对平板进行扫描，肽的MIC的确定按照比对照孔（11孔）的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。
最小杀菌浓度MBC（minimalbactericidalconcentration）就是能抑制任何残余菌落生长的肽的最低浓度。从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10µL涂布到MH琼脂平板上，37˚C培养18h，以此来确定肽的MBC。

参考文献：
【1】汪以真，抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较[J].中国兽医学报，2004，24（3）：270-273.

抗菌肽的体外抑菌实验（平板法）
稀释：将一定效价的抗菌肽做6个浓度的稀释，将抗生素按正常使用剂量同样做6个浓度的稀释
指示菌：指示菌用液体LB培养基培养24h后稀释至10^6CFU/mL
制板：取1mL指示菌注入培养皿中，倒入灭菌的固体LB培养基摇匀，放冷后制成平板。
用打孔器打孔法来确定抑菌效果。

参考文献：
李晓营，等.一种抗菌肽的体外抑菌实验、安全性评价及其对肠道菌群的影响[J].广东饲料，2014，23（2）：25-28