基因克隆的酶学基础.ppt

第三章基因克隆的酶学基础1.简述DNA的碱基通过磷酸二酯键连接限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割
DNA连接酶—用于连接两条DNA分子或片段
反转录酶—以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化
多核苷酸激酶—将一个磷酸分子加到多核苷酸链的5’-OH末端
碱性磷酸酶—催化从DNA分子的5’或3’端移去末端磷酸基团
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割
核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成
核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰
其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。2.性质：1.1寄主控制的限制与修饰现象
（1）限制（Restriction）1.2限制性内切酶的发现

1.细菌限制修饰系统的发现
WernerArber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。
2.限制酶HindII的发现
H．O．Smith和Wilox于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。
3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制
D.Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。1.3核酸内切酶的类型III型核酸限制性内切酶的特性1.4II型核酸限制性内切酶的基本特性
1.识别顺序和酶切位点

１）识别４、6、8个相连的核苷酸

2）对称性—双对称
EcoRI5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
3）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
4）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2.末端种类（粘性末端、平末端）
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAOHPG-3’
3’-GACGTC-5’3’-GPHOACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’３）平齐末端
SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’
４）非互补的粘性末端
i）切点在识别顺序之外的，如：FokI
FokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)9
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13
ii）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG3同裂酶（isoschizomers）①完全同裂酶XmaI5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’4.同尾酶（isocaudamer）5.限制片段末端的连接作用
1.5限制性内切酶的命名

命名原则：（1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称；（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型；（3）几个不同的限制与修饰体系以罗马数字表示。
例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
EcoRI—EscherichiacoliRI
HindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢ
SacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)1.6影响限制性内切酶活性的因素2.DNA的甲基化程度5.酶反应的缓冲液表1具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶诱发星活性的条件a识别序列
AvaI1,2,4
BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCC
BstI2,4
BsuI2,4,6
EcoRI1,2,4-6NAATTN
HaeⅢ2,4
HhaI2,4,7
HindⅢ6
HpaI1,2,4
PstI1,2,4,7
PvuⅡ2,4
SalI1,2,4,7
ScaI4-6,8
SstⅡ2,4
XbaI2,4,7
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；
5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亚砜(8%);8:无NaCl。1.7限制性内切酶在实验中的使用•酶从冰箱取出后请一直置于冰上。
•酶最后加入到反应体系中。

•加入酶之后将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。

•当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋DNA时，通常需要超过1unit/μg的酶量以达到完全酶切。双酶切双酶切时应注意：第二节DNA连接酶DN