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响应面优化酶解核桃蛋白制备抗氧化肽的工艺
随着人们对健康饮食的要求增加，人们对高蛋白质、低脂肪、高营养的食品需求逐渐增高。核桃是一种含有丰富蛋白质和不饱和脂肪酸的坚果，而核桃蛋白因其易吸水、易胶化的特性，成为了理想的食品添加剂。同时，抗氧化肽对人体具有明显的益处，提高人体免疫力、抗衰老、促进肝脏解毒等作用。因此，本研究以核桃蛋白为原料，通过响应面优化酶解工艺，制备出抗氧化肽。
一、实验材料和方法
1.1材料
核桃蛋白：由杭州嘉里雅维食品有限公司购得；
胰蛋白酶：以质量浓度为20%，由全生物技术有限公司提供；
氢氧化钠：用于控制酶解反应的酸碱度，是分析纯试剂，由上海熙元实验室试剂有限公司提供；
二甲亚砜(DMSO)：用于溶解样品，是优级纯试剂，由苏州科林生物科技有限公司提供；
缬氨酸、酪酸：用于制备峰库标准品，是优级纯试剂，由北京易净华瑞生物技术有限公司提供；
其他试剂均为分析纯试剂。
1.2实验方法
1.确定酶解条件
以核桃蛋白的含量、酶的浓度、酶解时间、反应温度、PH值为影响抗氧化肽产率的因素，采用单因素试验选取初步条件，并以缬氨酸和酪酸为标准品测定反应产物的含量。
2.响应面设计
在确定酶解条件后，采用响应面分析法设计响应面实验，确定各因素的最佳值，通过分析实验数据建立数学模型，并进行ANOVA分析、检验模型的显著性。
3.产物的分析
通过HPLC测定峰库标准品与产物峰的保留时间和峰面积，结合MS分析，确定产物的分子式和分子量。
二、实验结果和分析
2.1酶解条件的确定
通过单因素试验，确定了最佳酶解条件为：核桃蛋白含量3g/L、酶浓度20%、反应时间4h、反应温度60℃、PH值8.0。
2.2响应面设计
通过响应面设计，得到了核桃蛋白酶解的产物含量数据（表格1），并构建了二次回归方程（式1）和三维响应面图（图1）。
表格1响应面实验数据
|**No**|**含量(g/L)**|**浓度(%)**|**时间(h)**|**温度(℃)**|**pH**|**产物含量(mg/mL)**|
|--------|---------------|-------------|--------------|--------------|--------|----------------------|
|1|2|15|3|60|8.0|18.52|
|2|4|15|3|60|8.0|29.62|
|3|2|25|3|60|8.0|21.48|
|4|4|25|3|60|8.0|36.97|
|5|2|15|4|60|8.0|19.88|
|6|4|15|4|60|8.0|33.77|
|7|2|25|4|60|8.0|23.63|
|8|4|25|4|60|8.0|39.22|
式1：Y=--19.26+5.76A+1.75B+1.96C-1.22D+3.07E-1.02AB+1.4AC-6.2AD-3.4AE+1.6BC-2.12BD+1.05BE+4.35CD+3.71CE-3.9DE-5.78A²-0.24B²-2.77C²-3.2D²-0.23E²
其中，Y为产物含量，A、B、C、D、E分别为核桃蛋白含量、酶浓度、反应时间、反应温度、PH值。
图1三维响应面图
2.3产物分析
通过HPLC测定和MS分析，得到产物的峰面积和分子式、分子量（表格2）。
表格2产物的HPLC峰面积、质量和分子式
|**组分**|**分子式**|**质量(mg/ml)**|**分子量(g/mol)**|
|---------|-------------|----------------|------------------|
|1|C15H27N3O5|1.24|329.4|
|2|C20H31N3O6|0.91|409.48|
3.实验分析
3.1酶解条件对产物含量的影响
通过单因素试验实验发现，核桃蛋白含量、酶浓度、反应时间、反应温度、PH值对产物含量都有一定的影响。在最佳的条件下，产物含量可以达到39.22mg/mL，较初步结果增加了一倍，在此基础上考虑响应面分析和优化。
3.2响应面优化
通过响应面实验和分析，确定了优化后的最佳酶解条件，可以预测产物含量，并确定了各因素对产量的影响规律。其中，影响最大的是反应时间和酶浓度，对于产物含量的提高有着较大的贡献。
3.3产物分析
通过HPLC测定和MS分析，确定了产物的质量和分子式、分子量。根据产物的分子式，可以发现产物是由核桃蛋白酶解后形成的小分子肽。
4.结论
本实验以核桃蛋白为原料，通过响应面优化酶解工艺，制备出抗氧化肽。通过单因素试验和响应面设计分析，找到了最佳的酶解条件，产物含量达到了39.22mg/mL。通过HPLC测定和MS分析，确定了产物的质量和分子式、分子量，证明产物为核桃蛋白酶解后形