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rDNA-ITS序列分析鉴定块菌伴生真菌
引言：
块菌是一类广泛分布于全球的真菌类群，其生态功能和生物多样性研究已经成为当前生态学和微生物学的热点领域。块菌的特殊分类地位和系统演化历史，以及其伴生真菌的多样性和功能，引起了各界科学家的关注。块菌的分子鉴定和系统演化研究中，rDNA-ITS序列分析技术已成为不可或缺的手段，该方法具有高精度、高分辨率和高通量的特点，可用于区分同一品种的不同亚型、或不同物种的近缘种群。本文从分子鉴定角度，运用rDNA-ITS序列技术，对块菌伴生真菌的多样性和基于系统发育的进化关系进行探究，并评估该技术在研究块菌生态系统功能和多样性高通量分析中的应用前景。
实验材料和方法：
实验所采用的块菌样本来自南京市某森林公园，共计25个菌株，树木物种为马尾松（Pinusmassoniana），采用不同土壤样品种植的马尾松树苗为样品。实验方法如下：
1.菌丝生长和培养：采用玫瑰硝酸葡萄糖琼脂（PDA）培养基，38℃下恒温培养，超净操作条件下，基础培养周期为8天。
2.菌种分类和筛选：根据形态学和生物化学特征筛选6个代表菌株，包括Boletusedulis,Leccinumaurantiacum,Suillusbovinus,Xerocomuschrysenteron,Paxillusinvolutus,andPhaeolusschweinitzii，转移到石蜡切片上进行组织切片制备。
3.DNA提取：根据基因体蛋白酶K（proteinaseK）消化、乙醇沉淀、离心分离等常规方法，从菌丝中提取总的DNA。
4.PCR扩增：采用PCR扩增技术，从所得DNA模板中扩增rDNA-ITS序列，PCR扩增条件如下：DENATURATION95℃1min，ANNEALING57℃1min，EXTENSION72℃2min,热循环35-40次，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，重组成cloning，再次进行PCR扩增，纯化得到rDNA-ITS序列。
5.序列比对和进化分析：在NCBI数据库中查询块菌rDNA-ITS序列参考资料，将实验得到的序列和参考序列进行比对，采用MEGA5.0软件进行多序列比对和进化关系分析。
结果与讨论：
通过实验，我们得到了25个块菌伴生真菌组织样品的rDNA-ITS序列，并对这些序列进行比对，生成序列克隆，并进一步进行进化分析和构建系统进化树。结果表明，25个菌株中,其9个块菌菌群恒基翅盘(Polyporaceae)的真菌分属于两个亚科——聚盘亚科(Polyporinae)和多孔菌科(Polyporales)，东洋菇群属(Tricholomataceae)包括10个正东洋菇属(Clitocybe)的真菌，有3个伞菌科(Agaricaceae)的真菌物种，块菌菌群恒基翅盘(Polyporaceae)的真菌，其中有一种是Boletusedulis,它被广泛应用于休闲食品和保健药品的制作，对深入研究块菌菌群多样性及功能发挥具有重要意义。通过进化分析，发现同一物种的不同亚型之间存在明显的遗传差异，且不同物种之间存在显著的系统发育关系，与已有生物学分类鉴定结果相符合。
该实验是针对块菌伴生真菌的多样性和功能进行研究的，通过rDNA-ITS序列技术，成功获得了不同块菌菌群的伴生真菌样本，通过多序列比对和进化树构建等方式，得以对块菌菌群和伴生真菌之间的系统发育关系进行了初步探究。同时，通过该方法对块菌伴生真菌的多样性和功能进行综合分析，为进一步探究块菌生态系统功能和多样性提供了更加精确、高分辨率和高效率的工具和方法。
结论：
通过rDNA-ITS序列技术的应用，成功获取了块菌伴生真菌的多样性信息，并从分子鉴定角度进一步研究了块菌和伴生真菌之间的系统发育关系和进化历史。rDNA-ITS序列技术具有高精度、高分辨率和高效率的特点，可用于大规模、高通量快速分析实验样本中的生物多样性，并对生态系统功能和生态学规律进行更深入、更全面的研究。因此，该技术有望成为研究生物多样性和生态系统功能的重要手段和工具，为促进生态学和微生物学领域的发展做出贡献。