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慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究
【摘要】目的：分离培养人骨髓来源间质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法：采取全骨髓贴壁培养法分离培养人骨髓MSCs。利用脂质体法进行慢病毒感染人骨髓MSCs。结果：分离培养出人骨髓来源的MSCs，并用携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。结论：获得人骨髓MSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰，为间质干细胞基因工程和组织工程研究奠定了基础。【关键词】间质干细胞;慢病毒;转染［Abstract］Objective:Toisolateandculturemesenchymalstemcellsderivedfromhumanbonemarrowandtransfectthecellsbylentiviral：ThetissueadherentculturemethodwasusedtoisolateMSCsfromhumanbonemarrow.TheMSCsweretransfectedbylentiviralvectorsusinglipofectamine2000.Results：HumanbonemarrowMSCsweresuccessfullyisolatedandefficientlytransfectedbyEGFP-expressinglentiviralvectors.Conclusion：HumanbonemarrowMSCshavebeentransfectedbylentivirus,whichwillplayaroleinresearchingonthefunctionofMSCsingeneandtissueengineering.［Keywords］mesenchymalstemcells；lentiviralvector;transfection间质干细胞存在于多种组织，主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、脐血及外周血等，骨髓是最常用的MSCs体外分离培养的组织来源。MSCs增殖能力强，体内外均具有多向分化潜能，基因修饰后保持原有多潜能性的同时可持续稳定表达外源基因；体外转染和培养一段时间移植至体内仍可存活，并能够迁移至病变部位,因而其成为基因治疗研究领域令人关注的靶细胞［1］。因此，本研究从人骨髓组织中分离培养出MSCs并体外扩增用于慢病毒转染，为进一步利用MSCs进行基因治疗奠定基础。1材料与方法标本和主要试剂成人骨髓，慢病毒三质粒系统FUGW，和VSVG，人胚肾293T，胎牛血清和L-DMEM，胰蛋白酶，lipofectamine2000转染试剂盒(Invitrogen公司），Polybrene，Trizol试剂，RT-PCR试剂盒，PCR试剂，质粒提取试剂盒，限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ。引物设计采用primerpremier软件，由上海生物工程有限公司合成。主要仪器二氧化碳培养箱，BeckmanSW28Rotor超速离心机，PCR仪，流式细胞仪(FACSCalibur,BD公司)，倒置式生物显微镜(TE300,Nikon公司)，细胞培养瓶和培养皿。方法人骨髓MSCs的分离扩增根据本室建立的方法分离培养人骨髓MSCs［2］。主要操作新鲜分离的骨髓液5ml加入含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，用吸管吹打混匀后，800r/min离心10min去除含脂滴上清。细胞沉淀种在含10%胎牛血清的L-DMEM营养液中，37℃、5%CO2饱和湿度培养。5d后半量换液,第7～10天后见有较多贴壁细胞后全量换液，此后每3天换液1次。细胞80%左右融合时,用含mmolEDTA-Na2的%胰酶室温消化,细胞沉淀按1∶3比例传代。待其生长接近融合层时，即得到人骨髓来源的MSCs。人骨髓MSCs表面标志检测取1×105第3代人骨髓MSCs与FITC或PE标记的鼠抗人CD13，CD29，CD44，CD105，CD31，CD34，HLA-Ⅰ及HLA-DR在4℃作用30min后，经流式细胞仪检测。阴性对照为FITC结合的鼠IgG1和PE结合的鼠IgG1。慢病毒包装在包装前1天种植293T细胞，10cm盘中细胞密度为6×105个细胞/盘，含10%FBS的L-DMEM10ml/盘培养过夜。第2天转染前换成无血清培养液，然后将15μgFUGW与12μg辅助质粒，9μg包膜质粒VSVG用无血清培养液稀释至ml，同时将30μl的lipofectamine2000脂质体复合物稀释至ml，室温静置5min后将脂质体复合物加至质粒复合物中，混匀后室温静置15min。将上述混合体系加入293T细胞中，8～16h后换成含10%FBS的L-DMEM，每盘10ml，37℃、5％CO2培养。48～72h后收集病毒上清