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小麦TaHDA19基因的克隆及胁迫表达分析
引言
小麦是我国重要的粮食作物之一，其生长发育过程中受到各种逆境胁迫的影响。为了适应这些环境压力，小麦拥有一套复杂的反应机制，其中基因的调控起着至关重要的作用。TaHDA19基因是小麦中的一个重要调控基因，在胁迫条件下有着显著的表达差异。本研究旨在通过克隆和胁迫表达分析，进一步探究TaHDA19基因在小麦逆境适应中的作用和机制。
材料和方法
材料
本研究使用的小麦材料为普通小麦(TriticumaestivumL.cv.ChineseSpring)的种子。同时，在本研究分别利用PCR和RT-PCR技术分别克隆和扩增了TaHDA19基因的完整cDNA序列和启动子序列。
方法
1.PCR扩增TaHDA19基因的完整cDNA序列
提取小麦总RNA，利用反转录酶和随机引物逆转录成cDNA。根据TaHDA19基因的序列信息，设计一对特异引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为：95°C预变性5min，95°C变性30s，62°C退火1min，72°C延伸1.5min，共35个周期；72°C最终延伸10min，4°C保存。
2.扩增TaHDA19基因的启动子序列
根据Triticumaestivum的基因组序列，以TaHDA19基因的转录起始位点为起点设计特异引物。扩增反应条件为：95°C预变性5min；95°C变性30s；58°C退火1min，72°C延伸1.5min；共35个周期；72°C最终延伸10min，4°C保存。
3.分子克隆
将PCR扩增得到的完整cDNA序列和启动子序列单独连接到载体pMD19-T进行转化并筛选。经过PCR验证和序列分析后，获得了克隆得到的完整TaHDA19基因cDNA序列和启动子序列。
4.TaHDA19基因的胁迫表达分析
通过溶液注射法对小麦植株进行盐胁迫和低温胁迫处理。在不同处理时间点(0,1,3,6,12,24h)采集植株根、茎和叶片的组织样品，进行实时荧光定量PCR分析。
结果
成功克隆和扩增了TaHDA19基因的完整cDNA序列和启动子序列。克隆所得的TaHDA19基因cDNA与到达(NCBI)的序列一致，而启动子序列与已有的序列有一定的变异。实时荧光定量PCR结果显示，TaHDA19基因在小麦根、茎和叶片中均有表达。同时，经盐胁迫和低温胁迫后，TaHDA19基因表达量都被显著地上调。在给出不同时间点(0,1,3,6,12,24h)后，TaHDA19基因表达量始终呈上升趋势，在24小时后达到了最高峰。
讨论
TaHDA19基因是小麦中的一个重要基因，通过对其完整cDNA序列和启动子序列的克隆和分析，可以更好地理解TaHDA19基因在小麦中的功能和调控机制。同时，胁迫表达实验结果表明TaHDA19基因在小麦适应逆境中发挥着重要作用，在盐胁迫和低温胁迫条件下均有显著表达差异。
结论
通过克隆和胁迫表达实验的分析，我们可以初步了解TaHDA19基因在小麦中的调控机制和逆境适应作用。后续研究可以进一步深入探究该基因在小麦生长发育和逆境响应中的具体作用机制，为小麦的耐逆性育种提供有益的指导意义。