蛋白质一级结构的测定方法ppt课件.ppt

第二节蛋白质一级结构的测定一、蛋白质一级结构定义(primarystructure)
在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。
核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包括二硫键的位置。
意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋白质生理功能的必要基础。蛋白质序列测定的基本战略和步骤二、蛋白质一级结构的测定方法但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱、质谱(GCMS)等方法的相继出现。使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少，而且工作人员也大大减少。
当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综述及专著文献较多。
三测定前的准备工作及测定的一般步骤蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及－S－S－定位等。一级结构的测定方法①过甲酸氧化②巯基乙醇还原③Cleland‘s试剂的还原作用稳定SH基的方法：稳定SH基的方法：（B）氨乙基化2）末端分析19（1）N-末端测定B.氰酸盐法异硫氰酸苯酯（PTC或PITC）与N末端的α－氨基发生的反应，生成PTC－钛,在弱酸中自发环化转变成PTH－衍生物。该试剂称为Edman试剂。由于PTH－衍生物从多肽链上脱落下来对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋白质的一级结构。（1）N-末端测定C.二甲基氨基萘磺酰氯法氨肽酶法2）末端分析（2）C-末端分析（2）C-末端分析B.羧肽酶水解法羧肽酶法测
C末端C-末端分析C.C-端氨基酸选择性氚标记法：

使用氚标记是测定C-端氨基酸最好的办法，专一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于C-端脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）酸水解碱水解氨基酸的分离和含量测定层析氨基酸的分离②氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法

若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先把样品经酸水解，调节水解液的pH为3，使所有的氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的复杂性，各种氨基酸所带的电荷强度差异比较大，pH3时,对于酸性氨基酸来说虽然也带正电荷，但由于谷氨酸γ-羧基和天冬氨酸的β-羧基，都有不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此时，它所带的正点荷强度就更大。
酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果好，在洗脱过程中，使用不同pH和离子强度的洗脱液。经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸，按顺序进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基酸的光吸收图谱。3）氨基酸组成分析41各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子交换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸自动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（pI为2.98）最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.74）最后下来，三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.97）、苏氨酸（pI为6.53）和亮氨酸（pI为5.98）洗脱的顺序又如何呢?苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。
综上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因素：
（1）氨基酸分子所带的电荷；
（2）氨基酸分子的极性；
（3）氨基酸分子的形状和大小。3特殊氨基酸的测定
羟基：Ser（丝氨酸），Thr（苏氨酸），—OH
特性：在一般条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中的羟基都不解离。
反应：①与酸作用生成酯，如丝氨酸磷酯，蛋白质的磷酸化绝大多数都发生在丝氨酸残基上。
②许多种酰化剂能够与酶活性中心的丝氨酸羟基作用，导致酶失活。
③酪氨酸的酚基可与Folin反应的基础，可作为蛋白质定量。为Millon反应的基础。
咪唑基：His（组氨酸）,
特性：在生理条件（pH7）下，组氨酸的咪唑基具有缓冲作用。这是因为咪唑基一侧的去质子化和另一侧的质子化作用同步进行。pH6时，50％质子化，pH7时，90％去质子化。也就是说，在生理条件（pH7）下，组氨酸的咪唑基既可以作为质子的受体，也可以作为质子的供体。因此组氨酸在酶催化作用中，起非常重要的作用。
反应：Pauly反应（对氨基苯磺酸的重氮盐，红色产物）甲硫基：Met（甲硫氨酸）,－S－CH3
特性：甲硫氨基酸侧链上的甲硫基是一个强的亲核中心，容易与卤代烷发生亲核反应，生成烷基化产物。该种产物用巯基试剂处理可以除去