离子交换柱层析法分离氨基酸.ppt

离子交换柱层析法分离氨基酸一、实验目的和要求二、实验原理树脂对离子的亲和力，与水合离子半径、电荷及离子的极化程度有关。水合离子半径愈小、电荷愈高、极化程度愈大，则它的亲和力愈大。其中静电力起主要作用。
在ph=5.8的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。本试验所用氨基酸中，Asp(天冬氨酸)是酸性氨基酸，pI=2.97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，pI=9.74。
茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发生紫色反应三、实验试剂离子交换树脂转型示意图离子交换树脂分离氨基酸原理示意图四、实验器材五、实验步骤2、连接装置
梯度混合器→恒流泵→层析管→部分收集器
3、装柱
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度，一个同学一手手执烧杯，一手用玻璃棒快速在杯口搅动树脂，使树脂缓慢均匀的流入层析管。另一个同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度
注意：
1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀
2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很小，同时可以适当多加点水。最后一段加水和放水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂，但也不能溢出。
倒好的层析管
端面平整，无气泡，约18cm高
4．平衡：
将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取pH=5.8钠离子强度为0.45的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管内的pH和缓冲液一样）即可上样。在平衡同时进行调速：
调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。5．加样:
平衡好后，停止加入缓冲溶液，待缓冲溶液弯月面靠近树脂顶端时，关闭下端开口。加入0.5mL左右混合氨基酸溶液，待样品弯月面靠近树脂顶端时，立即用少量浓度为（0.45mol/L）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层析管内壁数次，再加入缓冲液约3～4厘米左右。加样时应避免冲破树脂表面，且避免将样品全部加在某一局限部位。
注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树脂表面

加样示意图6.洗脱并收集:
将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为0.45与0.9的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个烧杯中。其中0.45的加入到直接输出溶液的那个池，如图
将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，1.5ml/管×50。
注意：设置首管为1，若有50支管，建议末管号设置为517．氨基酸的鉴定：
向各管收集液中加1.5mL水合茚三酮显色剂并混匀（加显色剂规则为：前10管都加，以后每隔一管加一次，但当出现显色时，周围几管都加。）在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再在加过显色剂的试管中加1.5mL的50%乙醇溶液，放置10min。以收集液第二管为空白，对加过显色剂和乙醇的试管进行光波吸收测定（测定570nm波长的光吸收值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线注意：
1.试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可。水浴完成后用镊子和抹布把试管架拿出来。
2.应避免用手直接接触茚三酮。
六、思考题